1. Préparation et collecte de vers âgés pour l’isolement cellulaire
- Collectez les vers et préparez des tampons pour l’isolement cellulaire.
- Prélever les vers dans un tube conique de 15 ml. Laver les vers de la plaque avec 1,5 mL de tampon M9 (1 mM MgSO4, 85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4, pH 7,0) et centrifuger pendant 5 min à 1 600 x g. Jeter les vers surnageants et laver avec 1 mL de tampon M9. Répétez la centrifugation et le lavage jusqu’à cinq fois au total pour éliminer autant que possible la contamination par Escherichia coli.
REMARQUE : L’ajout d’antibiotiques (50 μg/mL), comme l’ampicilline, à cette étape peut aider à réduire la contamination bactérienne.
- Pour deux échantillons, préparer 2 mL de tampon de lyse de dodécylsulfate-dithiothréitol de sodium (SDS-DTT) : 200 mM de DTT, 0,25 % (p/v) de SDS, 20 mM de HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique) (pH 8,0) et 3 % (p/v) de saccharose.
- Préparez 15 mL de tampon d’isolement (118 mM de NaCl, 48 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES [pH 7,3]) et conservez-le sur de la glace.
note: Le tampon de lyse et le tampon d’isolement SDS-DTT doivent être mis à jour avant chaque expérience.
- Rupture cuticulaire et isolement d’une cellule unique
- Centrifuger les animaux prélevés à l’étape 1.1.1 pendant 5 min à 1 600 x g. Retirer tous les vers surnageants et en suspension dans 1 mL de milieu M9 et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
- Vers en granulés avec centrifugation à 1 600 x g pendant 5 min.
- Ajouter 200 μL de tampon de lyse SDS-DTT aux vers et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Les vers doivent sembler être « bigornés » le long du corps s’ils sont observés au microscope optique.
note: Une exposition prolongée au tampon de lyse SDS-DTT peut entraîner la mort des vers, qui peuvent être surveillés en observant les vers. Les vers morts s’allongent et ne s’enroulent pas.
- Ajouter 800 μL de tampon d’isolement glacé et mélanger en remuant doucement le tube.
- Utiliser les vers en granulés pendant 1 min à 13 000 x g à 4 °C, éliminer le surnageant et laver avec 1 mL de tampon d’isolement.
- Répétez l’étape 1.3.5 pour un total de cinq fois, en retirant soigneusement la mémoire tampon d’isolement à chaque fois.
- Ajouter 100 μL de mélange de protéase de Streptomyces griseus (15 mg/mL) (Table des matériaux) dissous dans un tampon d’isolement à la pastille et incuber pendant 10 à 15 min à RT.
note: Comme pour le tampon de lyse SDS-DTT, la digestion prolongée de la protéase peut entraîner un clivage excessif des protéines le long de la membrane plasmique, empêchant l’isolement de la protéine fluorescente verte (GFP) exposée en surface via des billes magnétiques.
- Pendant l’incubation avec un mélange de protéases, appliquer une perturbation mécanique en pipetant les échantillons de haut en bas contre le fond du tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec une pointe de micropipette de 200 μL pendant ~60 à 70 fois. Maintenez la pointe de la pipette contre la paroi du tube de microcentrifugation avec une pression constante pour dissocier correctement les cellules.
- Pour déterminer l’étape de la digestion, prélevez un petit volume (~1−5 μL) du mélange de digestion, déposez-le sur une lame de verre et inspectez-le à l’aide d’un microscope de culture tissulaire. Après 5 à 7 minutes d’incubation, les fragments de vers devraient avoir une cuticule visiblement réduite et une bouillie de cellules sera facilement visible.
- Réaction d'arrêt avec 900 μL de milieu froid L-15 de Leibovitz disponible dans le commerce, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et de pénicilline-streptomycine (concentration finale à 50 U/mL de pénicilline et 50 μg/mL de streptomycine).
- Isoler les fragments et les cellules des pastilles par centrifugation pendant 5 min à 10 000 x g à 4 °C. Laver les cellules des granulés avec 1 mL de milieu froid supplémenté en L-15 deux fois de plus pour s’assurer que l’excès de débris et de cuticules est éliminé.
- Remettre en suspension les cellules granulées dans 1 mL de milieu supplémenté en L-15 et laisser sur la glace pendant 30 min. Amener la couche supérieure, d’environ 700 à 800 μL, dans un tube de microcentrifugation. Cette couche contient des cellules sans débris cellulaires et sera utilisée pour l’isolement ultérieur des cellules d’intérêt.
- En suivant les instructions du fabricant, utilisez un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre pour mesurer la densité cellulaire de 10 à 25 μL de cellules isolées.
2. Isolement des cellules GFP positives par cytométrie en flux
- Isolement de cellules GFP-positives par cytométrie en flux
- À partir d’une suspension cellulaire isolée recueillie à l’étape 1.2.12, centrifuger les cellules pendant 5 min à 10 000 x g à 4 °C. Jeter le surnageant et suspendre les cellules granulées dans un milieu enrichi en L-15 jusqu’à une densité cellulaire ne dépassant pas 6 x 106 cellules/mL pour éviter de surcharger le cytomètre en flux.
- Triez les cellules par expression GFP positive à l’aide d’un cytomètre en flux capable de trier les échantillons. Les cellules GFP négatives peuvent être utilisées comme contrôle pour l’analyse non spécifique au type de cellule.
- Culture de cellules isolées
- Plaque isolée des cellules dans une plaque stérile à 6 puits multipuits.
note: Ces plaques peuvent être recouvertes de lectine d’arachide pour augmenter la fixation des cellules ; Cependant, si les cellules doivent être utilisées immédiatement, cette étape peut être ignorée.
- Placez la plaque dans un récipient en plastique et incubez les cellules à 20 °C avec une lingette humide ou du papier de soie doux (ajoutez 50 μg/mL d’ampicilline à de l’eau doublement distillée [ddH2O] pour éviter toute croissance bactérienne sur la lingette) pour ajouter de l’humidité aux cellules. N’incubez pas dans un incubateur de CO2, car des niveaux élevés de CO2 peuvent endommager les cellules.
