Obtention de tranches de cervelet à partir d’un cerveau de poussin embryonnaire

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dissection de l’embryon de poulet Jour 14 (e14) Cervelet

1. Incuber les œufs de poules fécondés bruns à 38 °C jusqu'au 14e jour embryonnaire.
2. À l’aide de ciseaux à œufs, décapitez l’embryon de poussin in ovo et placez la tête dans une boîte de Pétri contenant une solution saline tampon phosphate (PBS) glacée (figure 1A).
3. À l’aide d’une pince standard, faites des incisions derrière chaque œil à travers tout le tissu, en enlevant les yeux et la mâchoire supérieure. Faites une deuxième incision tout au long du pharynx, en enlevant la mâchoire inférieure (Figure 1B).
4. À l’aide d’une pince standard, retirez toute la peau de la surface d’un crâne en le décollant (Figure 1C) et retirez les os frontaux et pariétaux, révélant ainsi le cerveau.
5. D’une face ventrale, enlever le cartilage pharyngé et le mésenchyme auxiliaire.
6. D’un aspect dorsal, retirez soigneusement le mésenchyme dorsal jusqu’au cerveau postérieur, en prenant soin de ne pas endommager la pie, et séparez tout le cerveau (Figure 1D).
7. Faites une incision tout au long du tissu entre le mésencéphale et le rhodermoencéphale et séparez le mésencéphale, y compris le cervelet (Figure 1E).
8. Retirez tout le cervelet en faisant des incisions à travers le tissu aux jonctions latérales du cervelet et de la plaque alaire du cerveau postérieur, en prenant soin de maintenir l’intégrité de la pie, tout au long de la dissection (Figure 1F). Retirez également le plexus choroïde en formation (Figure 1G).
9. Déplacez le cervelet disséqué dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) glacée.

2. Culture en tranches du cervelet e14

1. Transférez l’ensemble du cervelet sur la plate-forme stérile d’un hachoir à tissus à l’aide d’une spatule ou d’une pipette Pasteur de 3 ml, avec l’embout coupé pour élargir l’ouverture. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette.
2. Coupez tout le cervelet dans l’orientation requise à 300 μm d’épaisseur à l’aide du kit de hachoir à tissus avec une vitesse de coupe à 50 % du maximum. L’intégrité des tissus est plus facilement préservée en coupe sagittale ; cependant, l’orientation est également une considération importante pour l’analyse cellulaire (les dendrites des cellules de Purkinje sont alignées sagittairement, tandis que les axones des cellules granulaires sont transversals, perpendiculaires au plan des dendrites des cellules de Purkinje).
3. À l’aide d’une pipette Pasteur de 3 ml, recouvrez le cervelet tranché de HBSS glacé.
4. Transférer les tranches de HBSS dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant du HBSS frais glacé à l’aide d’une pipette Pasteur de 3 ml avec une pointe coupée.
5. Sous un microscope de dissection éclairé par une source lumineuse à fibre optique, assurez la séparation des coupes individuelles à l’aide d’une pince d’horloger.
   note: Chaque dissection, de l’embryon à l’incubation de la tranche dans un milieu de culture, dure environ 10 à 20 minutes, selon l’expérience. Effectuez les dissections une à la fois pour vous assurer que le cervelet passe le minimum de temps entre la décapitation et la culture ex vivo.

Graphique 1. Dissection du cervelet à partir d’embryons de poussins E14. (A) Décapitez le poussin dans l’œuf et retirez la tête dans une boîte de Pétri avec du PBS glacé. Retirez la mâchoire inférieure et les yeux en faisant une incision derrière les yeux et le pharynx (ligne pointillée). (B) Retirez la peau de la surface du crâne. (C) Enlever les os frontaux et pariétaux, et (D) Retirer le cerveau du mésenchyme et du cartilage qui l’entourent. (E) À l’aide d’un microscope à dissection, identifiez l’emplacement du cervelet à l’extrémité postérieure du cerveau. Coupez entre le mésencéphale et le cerveau postérieur (lignes pointillées) pour être laissé avec le cervelet et le cerveau postérieur ventral. (F) Faites des incisions aux jonctions latérales (pédoncules) du cervelet pour séparer le cervelet du cerveau postérieur (ligne pointillée). (G) Retirez le plexus choroïde (astérisque) de la face ventrale du cervelet jusqu’à ce qu’il vous reste un cervelet entier intact avec la pia attachée. Transférez le cervelet dans du HBSS glacé avant de préparer les tranches avec un hachoir à mouchoirs.