Etablissement de cultures primaires de cellules gliales mixtes à partir d’une moelle épinière de souris

Résumé

Source : Malon, J. T., et al. Préparation de cultures gliales mixtes primaires à partir de tissus de moelle épinière de souris adultes. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo présente une technique d’isolement et de culture de cellules gliales primaires mixtes à partir de tissus de moelle épinière de souris adultes. Le protocole implique une digestion enzymatique du tissu, suivie de l’élimination des membranes cellulaires brisées et des débris de myéline pour obtenir une population unicellulaire. Les cellules sont ensuite cultivées dans un milieu optimisé pour la croissance de cellules gliales mixtes.

Protocole

1. Préparation des solutions dans une hotte de culture dans des conditions aseptiques

1. Préparez le milieu de culture : complétez le milieu de modification d'Eagle de Dulbecco (cDMEM) contenant du DMEM (avec 4,5 g/L de glucose), 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 UI/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, 250 ng/mL d'amphotéricine B et 50 μM de 2-mercaptoéthanol (2-ME ; voir 1.1.1). Mélangez et filtrez, stérilisez tous les autres composants, puis ajoutez le FBS. Conserver le milieu de culture à 4 ^°C.
   1. Préparer une solution mère de 50 mM de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 2-ME (2-ME) ; ajouter 100 μL de 2-ME concentré (14,3 M) dans 28,6 mL de 1x PBS et stériliser par filtre (la solution peut être conservée à 4 ^°C pendant plusieurs mois). Utiliser 1 mL de solution mère 2-ME pour 1 000 mL de milieu de culture.
2. Préparation du média à gradient de densité
   1. Préparez une solution mère de milieu à gradient de densité isotonique (p. ex., 100 % Percoll) à partir de 1 partie de PBS stérile 10x ordinaire et de 9 parties de milieu stérile à gradient de densité (p. ex., Percoll).
   2. Diluez le milieu à gradient de densité de 100 % (fabriqué en 1.2.1) avec du PBS stérile ordinaire 1x pour obtenir un milieu à gradient de densité de 20 % (p. ex., 10 mL de milieu à gradient de densité de 100 % avec 40 mL de PBS 1x) et conservez-le à 4 ^°C. Amenez le milieu à gradient de densité de 20 % à température ambiante (RT) avant de préparer la culture cellulaire.
3. Préparation de solutions à partir du système de dissociation de la papaïne
   REMARQUE : Le système de dissociation de la papaïne peut être identifié dans le tableau des matériaux. D’autres kits de dissociation similaires (y compris ceux assemblés en interne) peuvent également être utilisés. Tous les composants doivent être stériles.
   1. Ajouter 32 mL de solution saline équilibrée d'Earle (EBSS) au mélange d'inhibiteurs d'ovomucoïdes (poudre).
   2. Ajouter 5 mL d’EBSS dans un flacon de papaïne (poudre). Placez le flacon de papaïne dans un bain-marie à 37 ^°C pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que la papaïne soit dissoute.
   3. Ajouter 500 μL d’EBSS dans un flacon de DNase (poudre). Mélangez délicatement.
   4. Ajouter 250 μL de la solution de DNase (ci-dessus) dans le flacon de papaïne.
   5. Calculez la quantité totale du mélange papaïne/DNase ci-dessus nécessaire (environ 800 μL de mélange papaïne/DNase par moelle épinière de souris) et transférez le mélange nécessaire dans un tube de 50 ml pour la digestion des tissus. Conservez le reste dans le flacon d’origine à 4 °C pendant au moins deux semaines.
   6. Gardez tous les composants des kits sur la glace jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
4. Préparez des tubes de prélèvement de la moelle épinière : un tube stérile de 15 ml avec 5 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS ; du système de dissociation de la papaïne, pour le prélèvement de la moelle épinière) et un tube stérile de 15 ml avec 1 PBS (pour remplir la seringue de 5 ml). De plus, préparez une boîte de Pétri stérile (35 mm ou 60 mm) avec 5 ml de HBSS et conservez-la dans la hotte de culture.

2. Préparation de la suspension unicellulaire

Remarque : Effectuez les étapes 3 et 4 dans une hotte de culture pour que tout reste stérile.

1. Transférez toutes les moelles épinières dans la boîte de Pétri contenant HBSS. Coupez chacune des moelles épinières en plusieurs petits morceaux fins à l’aide de ciseaux stériles et de pinces. Transvaser le tissu de la moelle épinière dans le tube conique de 50 mL contenant le mélange d’enzymes papaïne/DNase préparé (étape 1.3.5) à l’aide d’une pince stérile ou d’une pipette de 10 mL (éviter d’ajouter du HBSS au mélange d’enzymes, car cela diluera davantage la solution enzymatique préparée et pourrait entraîner une diminution de la performance de l’enzyme).
2. Agitez doucement le tube pour mélanger. Incuber le tube à 37 ^°C pendant 1 h dans un incubateur/agitateur avec agitation orbitale à 150 tr/min.
3. Agitez à nouveau le tube et triturez vigoureusement la solution enzymatique avec le tissu à l’aide d’une pipette de 5 ml pour favoriser une dissociation supplémentaire.
4. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min à RT.
5. Pendant la centrifugation, mélanger 2,7 mL d’EBSS avec 300 μL de solution d’inhibiteur d’albumine-ovomucoïde reconstituée (1.3.1) dans un tube stérile. Ajouter 150 μL de la solution de DNase (étape 1.3.3).
6. Après la centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec la solution préparée ci-dessus (étape 1.5). Bien vortex pour casser la pastille de cellule.
7. Ajouter 3 mL de solution d’inhibiteur d’albumine-ovomucoïde reconstituée (étape 1.4.1) à la suspension cellulaire. Centrifuger les cellules à 70 x g pendant 6 min à RT. Retirer le surnageant (qui contient des fragments de membrane).

3. Élimination supplémentaire de la myéline de la suspension unicellulaire

1. Ajouter 8 mL de milieu à gradient de densité de 20 % (préparé à l’étape 1.2.2) dans le tube contenant la pastille de cellule, agiter doucement pour perturber la pastille et centrifuger les cellules à 800 x g pendant 30 min à RT sans freiner. Retirez soigneusement la couche supérieure de débris (principalement de la myéline) et le surnageant, mais conservez la pastille.
2. Pour éliminer les restes du gradient de densité, lavez les cellules en remettant en suspension la pastille cellulaire avec 8 mL d’un cDMEM dilué (1 partie de cDMEM et 2 parties de HBSS). Centrifugez les cellules à 400 x g pendant 10 min à 4 ^°C. Retirez le surnageant et lavez à nouveau les cellules avec le cDMEM dilué (ci-dessus) de la même manière. Gardez les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient ensemencées.
3. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture (cDMEM fourni avec du 2-ME (préparé à l’étape 1.1)). Pour une plaque à 12 puits, utiliser 3 mL x 4 (nombre de souris utilisées) + 2 mL = 14 mL de milieu. Cela garantira qu’il y a suffisamment de suspension cellulaire pour l’ensemble de la plaque (12 puits) et fournira des puits supplémentaires qui peuvent être utilisés pour déterminer le nombre moyen de cellules par puits et le contenu microglial de la culture. Si d’autres types de récipients de culture sont utilisés, calculez proportionnellement le volume total de milieux de culture nécessaires.
4. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 12 puits.
5. Incuber les cellules à 35,9 ^°C avec 5 % de CO₂.
6. Changez le support (retirez l’ancien support par aspiration) à J 1, puis tous les 3 à 4 jours par la suite (changez généralement le support à J : 1, 4, 8 et 11, puis utilisez les cellules le jour 12).
   note: Le jour 1, la culture peut contenir des quantités importantes de débris en raison de la myéline résiduelle du tissu de la moelle épinière ; Il est donc recommandé de changer de support le jour 1. Les cultures sont prêtes pour le traitement entre J 12 et 14. Les cellules sont généralement confluentes à 80 % à J 12 et peuvent être proches de 100 % à J 14. Typiquement, à J 12, il y a environ 100 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Modification par Dulbecco du milieu d'Eagle (DMEM) avec 4,5 g/L de glucose	Lonza	12-709F	Le milieu cDMEM est un milieu de culture standard et largement utilisé. Les chercheurs individuels peuvent décider où acheter le DMEM et tous les autres composants utilisés pour fabriquer des supports cDMEM.
L-Glutamine (100x)	Lonza	17-605E	La L-glutamine est un composant standard largement utilisé pour divers milieux de culture. Les chercheurs individuels peuvent décider où acheter de la L-glutamine.
Solution antibiotique-antimycosique (100x)	Corning-Mediatech	Référence 30-004-CI	Il s’agit d’une combinaison de pénicilline, de streptomycine et d’amphotéricine formulée pour contenir 10 000 unités/ml de pénicilline G, 10 mg/ml de sulfate de streptomycine et 25 μg/ml d’amphotéricine B. Les chercheurs peuvent décider où acheter des composants individuels.
2-mercaptoéthanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	Un BioReagent, adapté à la culture cellulaire, à la biologie moléculaire et à l’électrophorèse.
Système de dissociation de la papaïne	Société biochimique Worthington	LK003150	Les composants individuels de ce kit peuvent être achetés séparément.
Percoll	GE Soins de santé	Référence 17-0891-01	Percoll est vendu sous forme de solution stérile. Le Percoll non dilué peut être réautoclavé si nécessaire.
Incubateur/agitateur de ligne de laboratoire	Ligne Barstead/Labo	MaxQ4000	C’est l’incubateur/agitateur que nous avons actuellement. D’autres types de shakers peuvent être utilisés à la place.