Différenciation des cellules progénitrices otiques en cellules épithéliales sensorielles suivie d’un immunomarquage

Résumé

Source : Azadeh, J. et al., Initiation de la différenciation dans les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées.J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo démontre la différenciation des cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées (iMOP) en cellules épithéliales sensorielles. Il décrit les étapes impliquées dans la culture des cellules iMOP, la formation des otosphères, l’induction de la différenciation et la visualisation des composants cellulaires et des marqueurs de différenciation par microscopie à fluorescence pour confirmer la réussite de la différenciation cellulaire.

Protocole

1. Maintien de l’auto-renouvellement dans les cellules IMOP

1. Préparez le milieu de culture iMOP : DMEM/F12, 1X supplément de B27, 25 μg/ml de carbénicilline et 20 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF). Préparez 50 ml de milieu de culture iMOP à l’aide de réactifs stériles. Réchauffez 49 ml de DMEM/F12 dans un cône de 50 ml dans un bain-marie à 37 °C.
   1. Décongeler le supplément de 50X B27 et les aliquotes de carbénicilline de 100 mg/ml stérilisées par filtre pendant 5 min dans un bain-marie à 37 °C. Décongeler 100 μg/ml d’aliquote bFGF à RT. Ajouter 1 ml de 50X B27, 10 μl de 100 μg/ml de bFGF et 12,5 μl de 100 mg/ml de carbénicilline dans le DMEM/F12.
2. Utiliser 3 ml de milieu dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm pour la culture de cellules iMOP. Ajoutez des médias frais aux cultures tous les deux jours en doublant le volume de médias. Veiller à ce que la concentration de bFGF ne descende pas en dessous de 5 ng/ml.
   1. Cultiver des cellules iMOP à 37 °C avec 5 % de CO_2. Passage des cellules en culture après 5 à 7 jours, comme indiqué dans les étapes ci-dessous. Transférez la culture dans un cône de 15 ml à l’aide d’une pointe de pipette de 10 ml.
3. Préparez 1 mM d’EDTA dans HBSS en diluant 0,1 ml d’EDTA 0,5 M pH 8,0 dans 50 ml de HBSS. Préchauffage 1 mM d’EDTA fabriqué en HBSS dans un bain-marie à 37 °C.
4. Récolter les cellules par gravité, sédimentation ou centrifugation à 200 x g pendant 5 min à RT. Pour la sédimentation par gravité, placez le cône de 15 ml contenant les cultures dans l’incubateur à 37 °C pendant 5 à 10 min. Après ce temps, observez les otosphères s’accumuler au fond du conique.
   de 15 ml. note: Une force centrifuge excessive peut endommager les cellules.
5. Aspirez soigneusement le milieu usagé à l’aide d’une pipette d’aspiration de 2 ml sans perturber la pastille de la cellule. Ajouter 0,5 ml de solution préchauffée de 1 mM D’EDTA HBSS à la pastille de cellule. À l’aide d’une pipette P1000, pipetez doucement de haut en bas 2 à 3 fois. Placer conique à 37 °C et incuber pendant <5 min pour faciliter la dissociation en cellules uniques.
6. Agitez doucement la solution cellulaire pour déterminer si les otosphères sont dissociés. Si aucune otosphère ne se sédimente au fond de la conique, les cellules se dissocient. Le temps d’incubation peut varier.
   note: Une incubation prolongée avec l’EDTA entraînera une mort cellulaire excessive.
7. Retirez les cellules à 37 °C, ajoutez 2 ml de milieu pour neutraliser et diluer l’EDTA. Prélever les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à RT. Aspirer l’EDTA dilué à l’aide d’une pipette aspirante de 2 ml et ajouter 5 ml de 1X PBS pour laver les cellules.
8. Faites tourner les cellules à 200 x g pendant 5 min à RT et aspirez 1X PBS à l’aide d’une pipette aspirante de 2 ml. Remettez les cellules en suspension à l’aide d’une pipette P1000 dans 0,5 ml de milieu de culture iMOP en pipetant doucement de haut en bas 2 à 3 fois.
9. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de particules microfluidique avec les cassettes appropriées. Une plaque confluente de cellules iMOP contiendra ~6 cellules X10⁶. Diluez les cellules à l’ordre de 1:100 dans un milieu et ajoutez 75 μl de solution cellulaire dans la cassette pour le comptage. Plaquez 1 x 10⁶ cellules dans une boîte de 6 cm dans un milieu de culture iMOP (dilution ~1:10). Passage iMOPs tous les 5 - 7 jours.
   note: Les cellules qui forment de grandes otosphères ou qui se fixent au fond de la boîte de culture tissulaire se différencieront. Les cellules mourront également si les cultures sont trop confluentes.

2. Différenciation des cellules IMOP en épithéliums sensoriels

1. Préparez 50 ml de milieu de différenciation des épithéliums sensoriels iMOP : DMEM/F12, 1X supplément de B27, 25 μg/ml de carbénicline. Préparez 50 ml de milieu de différenciation des épithéliums sensoriels iMOP. Réchauffez 49 ml de DMEM/F12 dans un cône de 50 ml dans un bain-marie à 37 °C. Décongeler un supplément de 50X B27 et des aliquotes de carbénicilline de 100 mg/ml pendant 5 minutes dans un bain-marie à 37 °C. Ajouter 1 ml de 50X B27 et 12,5 μl de 100 mg/ml de carbénicilline dans du DMEM/F12.
2. Pour récolter, dissocier, remettre en suspension et compter les cellules, répétez les étapes 1.4 à 1.9
3. Plaquez 1 x 10⁶ cellules dans une boîte de 6 cm au jour -3 à l’aide d’un milieu de culture iMOP. Le jour 0, transférez les cultures à l’aide d’une pipette de 10 ml dans un cône de 15 ml. Prélever les otosphères par sédimentation gravitaire, comme indiqué à l’étape 1.6. Aspirez le milieu usagé à l’aide d’une pipette d’aspiration de 2 ml et laissez les otosphères au fond de la conique.
4. Ajouter délicatement 2 ml de milieu de différenciation des épithéliums sensoriels. Transférez les otosphères dans une boîte de 6 cm à l’aide d’une pipette de 10 ml de grand calibre.
   note: Le cisaillement mécanique dû à un pipetage brutal peut dissocier les cellules des otosphères.
5. Ajouter 2 ml de milieu de différenciation épithéliale sensorielle frais aux cultures tous les deux jours. Si nécessaire, les cellules peuvent être collectées par sédimentation gravitaire et remplacées par des milieux.
6. Prélever les otosphères au jour 10 en les transférant dans un cône de 15 ml et en laissant les otosphères sédimenter comme indiqué à l’étape 1.6. Aspirez le milieu usagé à l’aide d’une pipette aspirante de 2 ml et laissez les otosphères intacts.
7. Fixez les otosphères en les incubant dans du formaldéhyde à 4 % dans 1 fois le PBS pendant 15 minutes à RT. Retirez la solution de formaldéhyde et lavez les otosphères avec un tampon de lavage (1 X PBS contenant 0,1 % de TritonX-100) avant de les incuber dans un tampon de blocage (1 X PBS contenant 10 % de sérum de chèvre normal et 0,1 % de Triton X-100) pendant 1 heure.
   1. Remplacez le tampon et incubez les échantillons dans le tampon de blocage avec des anticorps dilués. Incuber à 4 °C. Laver les échantillons avec du 1X PBS contenant 0,1 % de Triton X-100 et soumettre l’otosphère à une immunocoloration. Transférez les otosphères dans 1X PBS et placez les otosphères dans un support de montage sur une lame de verre à l’aide d’une pipette P1000. Placez une lamelle sur l’échantillon et laissez sécher le support de montage à 4 °C.
8. Acquérez des images d’épifluorescence à l’aide d’un microscope inversé équipé d’une caméra CCD 16 bits et d’un objectif à immersion dans l’huile 20X 0,75 air ou 40X 1,3 NA. Collectez la fluorescence de différents canaux de couleur en utilisant les longueurs d’onde répertoriées (excitation et émission) : bleu (377 ± 25 nm/447 ± 30 nm), vert (475 ± 25 nm/540 ± 25 nm), rouge (562 ± 20 nm/ et 625 ± 20 nm) et infrarouge (628 ± 20 nm et 692 ± 20 nm).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lamelle en verre de 1,5 épaisseur (ronde 12 mm)	Sciences de la microscopie électronique	Référence 72230-01
DMEM/F12	Technologies de la vie	Référence 11320-082
Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4	Technologies de la vie	Référence 10010-023
Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Technologies de la vie	Référence 14025-092
Supplément B27 (50X) Sans sérum	Technologies de la vie	Référence 17504-044	Stocké sous forme d’aliquotes de 1 ml
Montage anti-effacement Or Prolong	Technologies de la vie	Référence 47743 à 736	Stocké sous forme d’aliquotes de 10 mg/ml de 100 μl
Compteur de cellules automatisé Moxi Z Mini	Orflo	MXZ001
Cassette Moxi Z Type S	Orflo	MXC002
Facteur de croissance basique des fibroblastes murins recombinants (bFGF)	Peprotech	450-33	Remise en suspension dans de la BSA à 0,1 % dans H20 et stockée sous forme d’aliquotes à 20 mg/ml
Carbenicilline, sel disodique	Thermo Fisher Scientific	Réf. BP2648-1	Remise en suspension dans 10 mM Hepes pH 7,4 et stockée sous forme d’aliquotes de 100 mg/ml
Pipette de 5 ml emballée individuellement (200/caisse)	Thermo Fisher Scientific	Référence 1367811D
Pipette de 10 ml emballée individuellement (200/caisse)	Thermo Fisher Scientific	Référence 1367811E
Plat de 6 cm traité pour culture tissulaire	Thermo Fisher Scientific	130181
Pointes de pipette de filtre à un filtre 0,1-10 ul	Scientifique américain	Référence 1120-3810
AstuceUn filtre à pointes de pipette 1-20 ul	Scientifique américain	Référence 1120-1810
AstucePointes de pipette à filtre One 1-200 ul	Scientifique américain	Référence 1120-8810
Pointes de pipette de filtre One 101-1000 ul	Scientifique américain	Référence 1126-7810
Tubes coniques de 15 ml stériles 20 sachets de 25 tubes (500 tubes)	Scientifique américain	Référence 1475-0511
50 ml de tubes coniques stériles 20 sachets de 25 tubes (500 tubes)	Scientifique américain	1500 à 1211