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Différenciation des progéniteurs otiques multipotents immortalisés en neurones ganglionnaires spiralés et évaluation de la différenciation

8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

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Source : Azadeh, J., et al. Initiation de la différenciation dans les cellules progénitrices otiques multipotentes immortalisées. J. Vis. Exp. (2016).

La vidéo démontre la différenciation des progéniteurs otiques multipotents immortalisés (iMOPs) en neurones ganglionnaires spiralés (SGN) et la confirmation de la différenciation basée sur l’immunofluorescence. Les iMOPs sont plaquées sur des lamelles recouvertes d’un substrat de culture dans un milieu de différenciation neuronale pour la différenciation en SGN. Les cellules différenciées sont marquées avec des anticorps spécifiques des marqueurs de différenciation neuronale et analysées au microscope pour confirmer la différenciation.

Protocole

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1. Différenciation des neurones dérivés de l’iMOP

  1. Préparez 50 ml de milieux de différenciation neuronale : milieux neurobasaux, 1X supplément de B27, 2 mM de L-Glutamine. Décongeler une bouteille de 50X B27 et 200 mM de L-Glutamine au bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Ajoutez 1 ml de 50X B27 et 0,5 ml de 200 mM de L-Glutamine à 48,5 ml de milieu neurobasal.
  2. Enduisez le couvre-objet en plaçant des lamelles rondes de 1,5 mm dans une plaque stérile de 10 cm et ajoutez 70 % d’éthanol (EtOH) à la plaque pour stériliser et nettoyer les lamelles.
  3. Agitez doucement les lamelles pour vous assurer qu’elles sont recouvertes d’éthanol. Laissez la plaque pendant 10 min à RT. Rincez les lamelles 3 fois avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) 1X pour éliminer l’éthanol restant. Rincez une fois la lamelle avec du H2O stérile pour laver le 1X PBS restant.
  4. Aspirez le H2O à l’aide d’une pipette d’aspiration de 2 ml et laissez sécher les lamelles. Exposez les lamelles à la lumière UV dans le capot de culture tissulaire pendant 15 min. Conservez les lamelles dans un environnement stérile si elles ne sont pas utilisées immédiatement.
  5. Placez une lamelle ronde de 12 mm dans chaque puits d’un plat de 24 puits. Agitez doucement la plaque pour vous assurer que les lamelles reposent à plat au fond du puits.
  6. Décongeler une solution mère de poly-D-lysine de 2 mg/ml à température ambiante (RT) et diluer à une concentration de 10 μg/ml de poly-D-lysine dans du PBS 1X. Ajouter 0,25 ml de poly-D-lysine à 10 μg/ml dans les puits. Laissez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 heure.
  7. Lavez les puits 3 fois avec du PBS stérile 1X. Décongeler 10 mg/ml de solution mère de laminine à RT et diluer à 10 μg/ml dans 1X PBS. Ajouter 0,25 ml de solution de travail de laminine de 10 μg/ml dans un seul puits d’une boîte de 24 plusieurs puits. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C. Aspirer la solution de laminine à l’aide d’une pipette d’aspiration de 2 ml.
  8. Lavez la lamelle 3 fois avec 1X PBS en ajoutant 1 ml de 1X PBS avec une pipette P1000 et en retirant 1X PBS en aspirant avec une pipette aspirante de 2 ml. Laissez 1X PBS du dernier lavage dans le puits jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être placées. Initier la différenciation neuronale en récoltant, dissociant et comptant les cellules. Assiette 1 x 106 cellules dans un plat de 6 cm au Jour -3.
  9. Le jour 0, récoltez, dissociez et comptez les cellules. Ensemencez 1 x 105 - 1,5 x 105 cellules iMOP dans 0,5 ml de milieu de différenciation neuronale préchauffé par puits dans une boîte de 24 plusieurs puits. Aspirez et ajoutez des milieux de différenciation neuronale préchauffés aux cultures tous les deux jours.
  10. Fixez les neurones dérivés d’iMOP dans du formaldéhyde à 4 % pendant 15 min. à la RT le jour 7. Retirer la solution de formaldéhyde, laver les neurones dérivés d’iMOP avec un tampon de lavage (1X PBS contenant 0,1 % de TritonX-100) avant de les incuber dans un tampon de blocage (1X PBS contenant 10 % de sérum de chèvre normal et 0,1 % de Triton X-100) pendant 1 heure.
    1. Remplacez le tampon et incubez les échantillons dans le tampon de blocage avec des anticorps dilués. Incuber à 4 °C. Laver les échantillons avec du 1X PBS contenant 0,1 % de cellules Triton X-100 soumises à l’immunomarquage. Lavez le verre de protection avec 1X PBS avant de le placer sur un support de montage. Laissez sécher le support de montage à 4 °C avant d’acquérir des images d’épifluorescence.

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lamelle en verre de 1,5 épaisseur (ronde 12 mm)Sciences de la microscopie électronique 7Référence 72230-01
DMEM/F12Technologies de la vieRéférence 11320-082
Milieu neurobasalTechnologies de la vieRéférence 21103
Saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4Technologies de la vieRéférence 10010-023
Supplément B27 (50X) Sans sérumTechnologies de la vieRéférence 17504-044Stocké sous forme d’aliquotes de 1 ml
L-Glutamine (200 mM)Technologies de la vieRéférence 25030-081Stocké sous forme d’aliquotes de 5 ml
Laminine de souris naturelleTechnologies de la vieRéférence 23017-015Stocké sous forme d’aliquotes de 1 mg/ml
Montage anti-effacement Or ProlongTechnologies de la vieRéférence 47743 à 736Stocké sous forme d’aliquotes de 10 mg/ml de 100 μl
Compteur de cellules automatisé Moxi Z MiniOrfloMXZ001
Cassette Moxi Z Type SOrfloMXC002
Poly-D-lysinesigmaP7886Remise en suspension dans 1X PBS et stockée sous forme d’aliquotes de 10 mg/ml de 100 μl
Pipette de 5 ml emballée individuellement (200/caisse)Thermo Fisher ScientificRéférence 1367811D
Pipette de 10 ml emballée individuellement (200/caisse)Thermo Fisher ScientificRéférence 1367811E
Plaque à 24 puits traitée pour la culture tissulaire BioliteThermo Fisher Scientific130188
Plaque à 6 puits traitée pour la culture tissulaire BioliteThermo Fisher Scientific130184
Plat de 6 cm traité pour culture tissulaireThermo Fisher Scientific130181
EMD Millipore Millex Seringue stérile PVDF Taille des pores : 0,22 μmThermo Fisher ScientificSLGV033RS
Pointes de pipette filtrantes à filtre One 0,1 - 10 μlScientifique américainRéférence 1120-3810
AstuceUn embout de pipette de filtre 1 - 20 μlScientifique américainRéférence 1120-1810
AstuceUn embout de pipette filtrant 1 - 200 μlScientifique américainRéférence 1120-8810
Pointes de pipette à filtre One 101 - 1000 μlScientifique américainRéférence 1126-7810
Tubes coniques de 15 ml stériles 20 sachets de 25 tubes (500 tubes)Scientifique américainRéférence 1475-0511
50 ml de tubes coniques stériles 20 sachets de 25 tubes (500 tubes)Scientifique américain1500 à 1211

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Mots-clés

Milieu de diff renciation neuronaleRev tement la poly D lysineRev tement la laminineMarquage par immunofluorescenceMicroscopie de fluorescenceAnticorps anti Cdkn1bAnticorps anti Tubb3Tampon de blocage

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