Toutes les procédures de modèle animal ont été examinées par le comité de protection des animaux de l’institution locale et le comité d’examen vétérinaire JoVE a examiné toutes les procédures de modèle animal.
1. Accouplements chronométrés
- Lieu : ISLMN :GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein ; MGI : J :132726 ; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J N° de stock : 017952) souris mâles et femelles ensemble pendant la nuit. Pesez les femelles et notez les poids avant l’accouplement.
REMARQUE : ISLMN :GFP marque spécifiquement les motoneurones avec une GFP farnésylée qui n’est pas cytotoxique, se localise dans la membrane cellulaire des motoneurones et de leurs axones, et permet de visualiser les nerfs pendant le développement. D’autres lignes marquées par fluorescence pourraient également être utilisées.
- Vérifiez s’il y a des bouchons vaginaux tôt le matin. La date d’identification d’une prise est désignée E0.5.
- Confirmer la grossesse à l’aide d’une prise de poids et/ou d’une échographie au 10,5e jour embryonnaire (E10.5). Les mères enceintes doivent avoir pris au moins 1 g. Les embryons peuvent être vus à l’échographie à E10.5.
2. Préparation des réactifs et du vibratome pour la culture en tranches
- Préparez 500 ml de tampon à trancher : ajoutez 5 ml d'HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique) et 5 ml de pénicilline/streptomycine à 500 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans Ca2+ ni Mg2+. Réfrigérer à 4 °C
note: Le tampon de tranchage supplémentaire doit être stocké à 4 °C et peut être utilisé pour de futures expériences de culture en tranches.
- Préparez 50 ml de milieu de culture : Dans une hotte stérile, ajoutez 12,5 ml de HBSS, 12,5 ml de sérum fœtal bovin (FBS), 250 μL de glucose, 250 μL de L-glutamine, 125 μL de HEPES à 24,4 ml de Fluorobright DMEM (milieu Eagle modifié de Dulbecco). (Concentrations finales : FlouroBright DMEM avec 25 % de HBSS, 25 % de FBS, 0,5 % de glucose, 1 mM de glutamine et 2,5 mM d’HEPES.). Réchauffer le milieu de culture à 37 °C dans un bain d’eau stérile.
note: Les milieux de culture peuvent être conservés à 4 °C pendant 3 semaines maximum.
- Dans une hotte stérile, ajouter 1,5 mL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Ajoutez un insert de culture cellulaire (table des matériaux) dans chaque puits. Placer dans un incubateur stérile à 37 °C et 5 % de CO2.
- Préparez de l’agarose à basse température de fusion à 4 % : dissoudre 2 g d’agarose à basse température de fusion dans 50 mL de PBS stérile. Cuire au micro-ondes à intervalles de 30 à 60 s jusqu’à dissolution complète. Placer dans un bain-marie à 40 °C pour garder le liquide.
note: L’agarose supplémentaire peut être conservée à température ambiante (RT) et fondue pour de futures expériences de culture en tranches.
- Configurer le vibratome : Placez une nouvelle lame sur le vibratome. Vérifier les paramètres : épaisseur 400-450 μm. Pré-refroidissez l’étage du vibratome. Placez de la glace dans la chambre extérieure. Utilisez une chambre et une scène dédiées aux tranches vivantes. N’utilisez pas la même chambre de vibratome pour les tissus fixés, car le fixateur résiduel pourrait endommager les tranches.
- Préparez l’incubateur supérieur de la platine du microscope à 37 °C et 5 % de CO2.
- Préparez-vous à la dissection : Nettoyez les instruments chirurgicaux et vaporisez de l’éthanol à 70 %. Remplissez deux boîtes de Pétri avec HBSS, placez-les sur de la glace. Ouvrez une plaque de culture tissulaire à 12 puits et placez le couvercle sur de la glace avec le dessous vers le haut. Ouvrez une plaque de culture tissulaire à 6 puits et placez des inserts de membrane de culture cellulaire et un milieu de culture cellulaire de 1,5 ml dans chaque puits. Préchauffez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
3. Récolte des embryons E10.5 et préparation des tranches
REMARQUE : Toutes les étapes à partir de ce point doivent être effectuées le plus rapidement possible. Gardez les embryons sur de la glace en tout temps.
- Euthanasier la mère gestante (E10.5) dans une chambre de CO2. Effectuer une luxation cervicale.
- Vaporisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Ouvrez l’abdomen avec des ciseaux, retirez l’utérus et placez-le dans une boîte de Pétri avec du HBSS glacé pour éliminer rapidement le sang. Déplacez l’utérus lavé vers un deuxième Petri rempli de HBSS glacé.
- Sous une lunette de dissection, prélevez les embryons de la corne utérine et des sacs amniotiques individuels. Placez les embryons sur la face inférieure du couvercle d’une plaque à 12 puits. Restez sur la glace.
- Sous une lunette de dissection, utilisez du papier filtre pour enlever tout liquide entourant chaque embryon.
note: Les embryons colleront au papier filtre s’ils sont touchés.
- Incorporer les embryons dans l’agarose. Versez de l’agarose fondue sur chaque embryon pour le couvrir. Restez sur la glace. Dès que l’agarose a durci, retournez chaque embryon et versez de l’agarose supplémentaire de l’autre côté. Restez sur la glace.
- À l’aide d’une lunette de dissection fluorescente, coupez l’agarose autour de chaque embryon afin qu’il soit correctement orienté lorsqu’il est collé à l’étage du vibratome. Le noyau oculomoteur et l’excroissance axonale précoce sont fluorescents. Alignez l’embryon de manière à ce que le noyau, les axones en expansion et l’œil forment une ligne, et coupez l’agarose avec une lame de rasoir coupée parallèlement à cette ligne (dorsale à l’embryon, voir Figure 1A).
note: Il s’agira du côté collé à l’étage du vibratome (l’embryon sera positionné sur le dos, la tête la plus proche de la lame du vibratome). Une ligne entre le noyau oculomoteur et l’œil doit être parallèle à la lame du vibratome.
- Remplissez la chambre du vibratome avec un tampon à tranches glacée. Supergluez l’embryon au stade du vibratome de sorte que la lame soit parallèle au noyau oculomoteur et aux yeux. Une fois que la superglue est sèche, immergez l’étape du vibratome de sorte que l’embryon soit orienté vers l’opposé de la lame.
- Trancher des tranches de 400 à 450 μm. Prélever chaque tranche à l’aide d’une pipette de transfert stérile. Placer dans un tampon à trancher froid.
- Sous la lunette de dissection, choisissez la tranche contenant les noyaux oculomoteurs et les yeux. À l’aide d’une pipette de transfert stérile, placez-le sur l’insert de culture cellulaire dans la plaque à 6 puits. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Sinon, demandez à une personne de trancher et à une autre de placer les tranches. Minimisez le temps entre le tranchage et le placement dans l’incubateur.
note: Les coupes doivent être orientées de manière à ce que la fluorescence maximale émise par les noyaux et les axones soit la plus proche de l’objectif du microscope d’imagerie. Sur un microscope inversé, les coupes doivent être placées sur la membrane avec les noyaux et les axones les plus proches de l’objectif sous la plaque.
- Retirez l’agarose résiduelle du stade de vibratome, supergluez l’embryon suivant au stade et répétez les étapes 3.7-3.9 jusqu’à ce que tous les embryons aient été tranchés et plaqués.
- Ajouter l’inhibiteur ou la molécule recombinante de votre choix au milieu dans chaque puits pour créer une courbe dose-réponse. Diluer dans un solvant approprié.
note: Si vous utilisez du diméthylsulfoxyde (DMSO), utilisez uniquement du DMSO de qualité culture tissulaire. Alternativement, des billes éluant des protéines peuvent être placées à des endroits spécifiques sur la tranche.
- Placer sur le microscope dans la chambre à 37 °C et 5 % de CO2. Réglez le microscope pour qu’il prenne des photos en contraste de phase et fluorescentes de chaque tranche toutes les 30 minutes (ou plus souvent si vous le souhaitez). Les tranches peuvent être maintenues pendant 48 à 72 h.
