Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des instruments, des solutions et des milieux
Remarque : Toutes les informations sur les matériaux, les réactifs, les outils et les instruments rapportées dans le protocole sont spécifiées dans la Table des matériaux.
- Autoclavez tous les instruments de dissection et rangez-les dans un endroit stérile. Utilisez les instruments suivants : 4 pinces standard (2 longues et 2 courtes) et 2 ciseaux, ainsi que 2 pinces (1 longue et 1 courte) et 1 ciseau pour la dissection ; Conservez un jeu supplémentaire en réserve.
- Préparez 100 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) et de sérum de veau fœtal à 1 % à utiliser pendant les lavages, les procédures d’immunomarquage et les étapes de tri cellulaire. Maintenir la solution au frais à 4 °C
note: N’ajoutez pas d’azoture de sodium (NaN3) à la solution, car il peut être toxique pour les cellules vivantes.
- Préparez 100 mL de PBS/1 % FBS avec 99 mL de PBS et 1 mL de FBS.
- Préparer 100 mL de milieu de cellules neurales stériles complété par 3 % de FBS (voir le tableau des matières) pour utilisation comme milieu de collecte et de culture. Maintenir le milieu de culture cellulaire stérile à 4 °C. Ne le réchauffez qu’à température ambiante (RT) avant de l’utiliser.
- Préparez 100 ml de milieu de cellules neurales complété par 3 % de FBS en utilisant 97 ml de milieu de cellules neurales et 3 ml de FBS.
- Tubes de prélèvement de pré-refroidissement (tubes de 15 ml) pré-enduits de 5 mL de milieu de collecte en les plaçant dans un seau à glace. N’utilisez que des tubes en polypropylène pour empêcher les cellules d’adhérer à la surface du tube.
- Placez des plats de 40 mm, des passoires en nylon de 70 μm, des seringues, des pilons pour la crépine cellulaire et des tubes stériles en polypropylène dans l’enceinte de biosécurité. Stérilisez tous les articles avant les procédures et maintenez-les de manière stérile tout au long des procédures.
note: Toutes les étapes après la collecte des rétines seront effectuées dans l’enceinte de biosécurité.
2. Préparation de la suspension de cellules rétiniennes
- Placez l’œil prélevé sur la plaque de base d’un microscope de dissection pour commencer la dissection cornéenne. Disséquez chaque œil individuellement.
- Tenez soigneusement le globe à la base du nerf optique à l’aide d’une pince. Pour cette étape, utilisez une pince standard longue et une pince standard courte.
- Utilisez une aiguille pointue de calibre 30 (30G) pour percer la cornée. Cela permettra à l’humeur aqueuse de s’évacuer de l’œil, ce qui facilitera la tenue de l’œil avec la pince.
- Tenez la cornée avec la pince et utilisez des ciseaux pour faire une petite incision dans la cornée. Pelez doucement la cornée et la sclérotique à l’aide de la pince. Lorsque le globe est pelé à moitié, faites rouler la rétine et le cristallin à l’aide de la pince. Jetez la cornée, la sclère et le cristallin.
note: Cette méthode garantit que la rétine se détache complètement du reste de l’œil.
- Placez la rétine dans une petite boîte de Pétri de 40 mm contenant PBS/1 % FBS.
note: Comme alternative à la boîte de Pétri, une boîte de culture cellulaire peut être utilisée. Assurez-vous de toujours garder les rétines humides, comme dans les conditions physiologiques.
- Lavez chaque rétine trois fois avec du PBS/1 % FBS stérile frais dans l’enceinte de biosécurité.
- Placez jusqu’à 12 rétines sur une passoire en nylon stérile de 70 μm imbibée de PBS/1 % FBS. À l’aide de l’extrémité arrière d’une seringue de 10 ml, faites macérer doucement la rétine en effectuant un mouvement circulaire pour détacher les cellules.
- Alternativement, utilisez un pilon pour la macération de la passoire cellulaire ou utilisez la digestion enzymatique avec une combinaison de 15 UI/mL de papaïne, 5 mM de L-cystéine et 200 U/mL de DNase I pendant 15 min à 37 °C, suivie d’une inactivation avec PBS/10 % FBS.
note: Aucun changement dans le pourcentage de cellules récupérées n’a été observé lorsque la digestion enzymatique a été comparée à la macération avec l’extrémité arrière de la seringue ou le pilon.
- Pour transférer les cellules isolées, placez la passoire stérile en nylon de 70 μm sur le tube de collecte en polypropylène. Passez les cellules collectées dans la passoire à l’aide d’une pipette P1000. Rincez la passoire (étape 3.6) avec du PBS/1 % FBS pour libérer les cellules restantes et transférez-les dans le tube de prélèvement.
- Ajouter PBS/1 % FBS pour obtenir un volume final de 1 mL par rétine. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 7 min à 200 x g et RT.
Remarque : Selon le nombre de rétines macérées (< 6 rétines), la pastille cellulaire peut être trop petite pour être visible.
- Jetez le surnageant cellulaire et remettez en suspension la pastille cellulaire dans PBS/1 % FBS en utilisant un rapport de 1 mL par 5 rétiniens.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Nettoyez un hémocytomètre en verre et une lamelle avec de l’alcool à 70 %. Faites tourner doucement le tube contenant les cellules pour vous assurer que la suspension des cellules de la rétine est uniformément répartie. Placez 20 μL de bleu de trypan à 0,4 % dans un tube de microcentrifugation et mélangez avec 20 μL de suspension cellulaire.
- Mélanger délicatement et appliquer 10 μL du mélange de suspension de bleu de trypan à 0,4 % et de cellules dans l’hémocytomètre, en remplissant les deux chambres ; l’action capillaire entraînera le mélange de bleu de trypan et de suspension de cellules à 0,4 % sous la lamelle. À l’aide d’un microscope, comptez toutes les cellules négatives au bleu trypan ; Ce nombre représente les cellules vivantes.
- Déterminez la viabilité cellulaire à l’aide de la formule suivante : nombre de cellules vivantes / nombre total de cellules = % de viabilité.
note: Si la viabilité des cellules est inférieure à 95 %, un colorant fluorescent est nécessaire pour discriminer la viabilité cellulaire lors du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
- Utilisez un colorant de viabilité fluorescent qui n’est pas perméable aux cellules vivantes. Lavez les cellules avec du PBS pour éliminer toute trace de sérum. Ajouter 1 μL de colorant fluorescent pour la discrimination de la viabilité cellulaire par 5,0 x 106 cellules dans un volume final de 100 μL. Incuber à RT pendant 15 min, à l’abri de la lumière. Ajoutez 10 fois le volume de PBS/1 % FBS. Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g et RT.
- Si nécessaire, incuber la suspension cellulaire pendant la nuit à 4 °C. Si cela est fait, remplissez le tube de suspension cellulaire avec un milieu cellulaire neural plutôt que PBS/1 % FBS. Placez le tube horizontalement et maintenez-le à 4 °C.
3. Immunomarquage des cellules rétiniennes
- Utilisez la conversion suivante pour déterminer le volume d’anticorps par numéro de cellule : 2 μL d’anticorps par 5,0 x 106 cellules dans un volume de 100 μL.
- Lavez les cellules et maintenez-les dans PBS/1 % FBS. Prélever une petite aliquote de cellules (5,0 x 106 cellules) à utiliser comme témoin négatif (non étiqueté) au moment de la mise en place du tri.
note: Ce contrôle négatif est essentiel pour le bon calibrage du trieur de cellules.
- Pour minimiser la liaison non spécifique des anticorps aux cellules qui expriment les récepteurs Fcγ II et III, ajouter 1 μL d’un anticorps CD16/32 anti-souris par 1,0 x 106 cellules dans un volume final de 50 μL en utilisant PBS/1 % FBS. Incuber pendant 10 min à RT.
- Ajoutez le cocktail d’anticorps à l’échantillon et mélangez doucement par pipetage. Incuber pendant 30 min dans un seau à glace. Assurez-vous que le seau à glace est couvert, car la lumière pourrait compromettre l’expérience en raison du photoblanchiment des fluorophores marqués.
- Préparez le cocktail d’anticorps à l’aide des anticorps anti-souris suivants marqués par fluorescence : CD90.2 AF (Alexa fluor)-700, CD48 PE (phycoérythrine)-Cyanine7, CD15 PE et CD57.
non étiqueté
Remarque : Pour chaque anticorps, utiliser les concentrations suivantes par 5,0 x 106 cellules : CD90.2 AF700, 1 μg ; CD48 PE-cyanine7, 0,4 μg ; CD15 PE, 0,02 μg ; et CD57 non marqué, 0,4 μg.
- Utiliser les volumes selon les calculs suivants (d’après les anticorps disponibles sur le marché énumérés dans le tableau des matières) : total de 5,0 x 107 cellules à étiqueter ; 2 μL par 5,0 x 106 cellules = 20 μL de chaque anticorps ; 4 anticorps différents = 80 μL de cocktail d’anticorps ; volume final = [(5,0 x 107 cellules au total)/5,0 x 106 cellules] x 100 = 1 000 μL ; 80 μL d’Abs + 50 μL d’anti-souris CD16/32 + 870 μL PBS/1 % FBS = 1 000 μL.
note: Cette combinaison a fourni la combinaison optimale de fluorochromes pour la configuration de l’instrument. Les paramètres suivants résument l’émission et l’excitation : AF-700, émission de 719 nm lorsqu’elle est excitée avec un laser à diode rouge de 638 nm ; PE-Cyanine7, émission de 767 nm lorsqu’elle est excitée par un laser à diode bleue de 488 nm ; et PE, émission de 575 nm lorsqu’elle est excitée par un laser à diode bleue de 488 nm.
- Après l’incubation de 30 minutes, porter le volume à 5 mL en utilisant PBS/1 % FBS. Lavez les échantillons en les centrifugeant pendant 7 min à 200 x g et RT. Répétez la procédure une fois pour éliminer tous les anticorps non liés.
- Ajoutez 2 μL d’anticorps secondaires (0,1 μg), qui se liera au CD57 de 5,0 x 106 cellules. Incuber pendant 30 minutes dans un seau à glace, comme à l’étape 3.4. Lavez les cellules deux fois, comme à l’étape 3.5.
- Étiquetez les cellules avec un anticorps secondaire si un anticorps primaire non marqué a été utilisé à l’étape 3.4.
Remarque : L’anticorps secondaire de choix pour cette configuration est répertorié dans la table des matériaux. Il a une longueur d’onde d’émission de 421 nm. Utilisez-le avec un filtre passe-bande de 450/50 nm lorsqu’il est excité avec le laser à diode violette à 405 nm.
- Utiliser les volumes selon les calculs suivants (d’après les anticorps disponibles sur le marché énumérés dans la Table des matières) : 2 μL par 5,0 x 106 cellules = 20 μL d’anticorps secondaires ; volume final = [(5,0 x 107 cellules au total)/5,0 x 106 cellules] x 50 = 500 μL ; 20 μL d’Abs + 480 μL de PBS/1 % FBS = 500 μL.
- Conservez les cellules marquées en PBS/1 % FBS. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ; utiliser une concentration finale de cellules rétiniennes de 3,0 à 4,0 x 107 cellules/mL.
note: N’utilisez pas de milieu de culture cellulaire pour diluer les cellules car le rouge de phénol peut augmenter l’autofluorescence, réduisant ainsi la résolution entre les cellules négatives et positives. La concentration finale de la cellule par volume dépend fortement du débit volumique de la configuration de l’instrument.
- Utilisez des commandes monochromes lors de la configuration pour minimiser les débordements de fluorescence.
note: Cette étape, également appelée compensation, est appliquée pour corriger le bruit créé par la combinaison de fluorophores. Les microsphères de polystyrène dans le PBS/0,1 % BSA/2 mM NaN3 ayant la capacité de se lier à des isotypes d’immunoglobulines (Ig) marqués par fluorescence de plusieurs espèces fournissent des contrôles positifs pour définir la compensation.
- Placez 3 gouttes de microsphères de polystyrène dans des tubes FACS stériles, en allouant une par fluorophore. Ajoutez 1 μg du fluorophore correspondant dans chaque tube. Incuber pendant 15 min à RT, à l’abri de la lumière. Ajouter 3 mL de PBS/1 % FBS dans les tubes d’échantillon. Centrifuger pendant 5 min à 200 x g et RT. Retirer délicatement le surnageant et le remettre en suspension dans 250 μL de PBS/1 % FBS.
- Pour mettre en place les contrôles négatifs, utilisez des microsphères de polystyrène qui ne se lient pas aux Ig. Si nécessaire, effectuez cette étape la veille.