Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
Les souris C57BL/6 et Fpr-rs3-i-Venus ont été logées en groupes des deux sexes à température ambiante sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures, avec de la nourriture et de l’eau disponibles à volonté. Pour les expériences, de jeunes adultes (6 à 20 semaines) des deux sexes ont été utilisés. Aucune différence évidente selon le sexe n’a été observée.
1. Préparation de la solution
- Préparer la solution extracellulaire S1 : solution extracellulaire tamponnée à l’acide 4-(2-hydroxy-éthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) contenant (en mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES ; pH = 7,3 (ajusté avec NaOH) ; osmolarité = 300 mOsm (ajusté avec le glucose).
- Préparer la solution extracellulaire S2 : solution extracellulaire oxygénée au carbogen (95 % O2, 5 % CO2) contenant (en mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, 5 BES (acide bis(2-hydroxyéthyl)-2-aminoéthanesulfonique) ; pH = 7,3 ; osmolarité = 300 mOsm (ajustée avec le glucose).
- Préparer une solution d’agarose à 4 % à basse température gélifiante (S3) pour l’enrobage tissulaire : agarose à 4 % à basse température gélifiante. Dissoudre 2 g d’agarose peu gélifiante dans 50 ml de S1 dans un flacon de laboratoire en verre de 100 ml avec un agitateur magnétique. Pour faire fondre l’agarose, mettez la bouteille dans un bain-marie (avec le couvercle non hermétiquement fermé) à 70 °C pendant environ 20 minutes ou jusqu’à ce que la solution devienne transparente en remuant. Refroidir et conserver l’agarose fondue dans un deuxième bain-marie à 42 °C jusqu’à nouvel ordre.
- Préparer la solution intracellulaire S4 : Solution pipette contenant (en mM) du 143 KCl, du 2 KOH, 1 EGTA (éthylène glycol-bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique), 0,3 CaCl2 (Ca2+ libre = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP (adénosine de magnésium 5'-triphosphate), 1 NaGTP (hydrate de sel de sodium de guanosine 5′-triphosphate) ; pH = 7,1 (ajusté avec KOH) ; osmolarité = 290 mOsm.
- Modifier ou ajuster la composition de S1, S2 et S4 en fonction de la conception expérimentale individuelle (p. ex., utiliser des bloqueurs pharmacologiques pour isoler certains types de courants activés par la tension).
2. Préparation de l’espace de travail
- Remplissez la chambre de stockage de la tranche oxygénante avec du S2 au moins 30 minutes avant la dissection, placez la tranche sur de la glace pour ajuster la température et le pH, et oxygénez la solution en continu.
- Remplissez le réservoir pour la superfusion en tranches lors de la configuration d’enregistrement avec S2 et oxygénez en continu.
- Avant la dissection, remplissez la chambre du vibratome avec du S2 et disposez de la glace pilée autour de la chambre. Vous pouvez également transférer la solution oxygénée glacée de rechange de la chambre d’oxygénation dans la chambre du vibratome et continuer à oxygéner en continu.
- Disposez les outils chirurgicaux et les consommables.
- Placez le bloc de glace sous le microscope de dissection et couvrez-le d’une serviette en papier pour éviter que le tissu VNO ne gèle au fond du plat.
- Nettoyez la lame du rasoir en la rinçant brièvement à l’éthanol à 70 % et à l’eau distillée, puis en la montant sur le vibratome. Remplacez-le à chaque séance de tranchage.
3. Dissection et intégration VNO
- Sacrifiez l’animal en l’exposant brièvement au CO2 et décapitez-le à l’aide de ciseaux chirurgicaux tranchants. note: Comme le temps entre le sacrifice de l’animal et la mise en place de la capsule VNO sur la glace est critique, minimisez le temps à moins de 2 min. Pour maintenir la viabilité des tissus, intégrez les deux VNO entièrement disséqués dans l’agarose en moins de 30 min.
- Retirez la mâchoire inférieure avec de gros ciseaux chirurgicaux. Entrez par la cavité buccale et coupez les os de la mandibule et les muscles de chaque côté séparément.
- Placez la partie restante de la tête à l’envers dans la grande boîte de Pétri.
- Retirez la peau de la mâchoire supérieure et autour du bout du nez avec une pince moyenne pour mieux accéder aux incisives.
- À l’aide de ciseaux à os, coupez la plus grande partie des incisives à un angle de ~45° dans la direction rostrale (figure 1A). Cela facilitera le retrait de la capsule VNO de la cavité nasale.
note: Ne coupez pas jusqu’à la racine de la dent pour éviter d’endommager l’extrémité de la capsule VNO.
- Saisissez le palais supérieur rigide par sa partie rostrale à l’aide d’une pince moyenne et retirez-le soigneusement en un seul morceau à un angle plat (Figure 1B).
note: Rincer à plusieurs reprises avec du S2 glacé.
- Utilisez des ciseaux à microressort pour couper la fusion osseuse entre la pointe de l’os vomer et la mâchoire. Insérez les pointes des ciseaux avec la partie incurvée de la pointe pointant vers l’extérieur à l’opposé du VNO et coupez soigneusement l’os par petites étapes sur les côtés gauche et droit latéraux de la capsule VNO.
- Pour retirer la capsule VNO, utilisez des ciseaux à micro-ressort pour couper l’os vomer au niveau de la partie caudale et retirez-le soigneusement de la cavité nasale à l’aide d’une pince moyenne. Transférez immédiatement le VNO dans une petite boîte de Pétri sous un stéréomicroscope sur un pack de gel réfrigérant, où les étapes restantes de la dissection seront effectuées.
- Rincez le VNO dans une petite quantité de S2 glacé pour éviter que le tissu ne se dessèche.
- Séparez les capsules cartilagineuses qui contiennent les tissus mous VNO en saisissant l’arrière de l’os vomer avec une pince moyenne. Positionnez la capsule pour une vue dorsale de sorte qu’une scission entre les deux VNO devienne visible (Figure 1Di).
- À l’aide de la pointe d’une pince fine, séparez les deux capsules de cartilage VNO de l’os central tout en maintenant l’os vomer fixé à l’arrière><.
note: Utilisez des pinces uniquement au bord de la capsule cartilagineuse et faites très attention à ne pas percer le cartilage car l’épithélium sensoriel délicat est facilement endommagé.
- Une fois que les deux VNO sont séparés, commencez à retirer le cartilage encapsulant le premier VNO.
- Saisissez le bord supérieur de la capsule à l’aide d’une pince fine et séparez la paroi cartilagineuse qui était précédemment attachée à l’os vomer (côté médial).
- Pour retirer le cartilage restant, tournez le VNO avec son côté latéral incurvé vers le fond de la boîte et fixez solidement le cartilage d’un côté à l’aide d’une pince. Déplacez avec précaution la deuxième pince fine de l’arrière à un angle très plat entre le cartilage et le VNO pour desserrer la connexion entre le tissu et le cartilage.
- Pour éviter d’endommager l’épithélium sensoriel, retirez lentement le VNO du cartilage en le tenant à son extrémité caudale.
- Une fois que le VNO est retiré de la capsule, retirez toutes les petites parties de cartilage restantes. Tous les morceaux de cartilage restants détacheront le tissu de l’agarose environnante pendant le processus de tranchage.
- Placez une petite goutte de S2 glacé sur le premier VNO disséqué pour éviter d’endommager les tissus. Un gros vaisseau sanguin sur la face latérale deviendra visible, indiquant que l’organe est toujours intact et n’a pas été gravement endommagé lors de la dissection. Si le vaisseau sanguin est endommagé, il sera toujours utile de continuer à trancher le VNO tant que la morphologie globale n’a pas été clairement altérée.
- Disséquez immédiatement le deuxième VNO.
- Pour encastrer les VNO, remplissez les deux petites boîtes de Pétri jusqu’au bord avec du S3 fondu (stocké dans un bain-marie à 42 °C ; voir 1.3).
- Tenez le VNO sur l’extrémité caudale la plus large avec des pinces fines pour éviter d’endommager l’épithélium sensoriel.
- Plongez le VNO dans l’agarose et déplacez-le horizontalement d’avant en arrière plusieurs fois pour retirer le film de la solution extracellulaire ainsi que toutes les bulles d’air de sa surface.
- Positionnez le VNO verticalement, avec l’extrémité caudale tournée vers le fond du plat. Au lieu de pincer directement le VNO avec la pince, déplacez l’extrémité de la pince à proximité du VNO pour ajuster l’orientation.
note: L’orientation lors de l’intégration est cruciale car elle détermine le plan de coupe et l’accessibilité aux neurones sensoriels pendant l’expérience.
- Placez la vaisselle sur un sac de glace en gel et attendez que l’agarose se soit solidifiée.
note: Ne changez pas l’orientation du VNO une fois que l’agarose s’est solidifiée, car cela détacherait le tissu de l’agarose environnante.
4. Découpage des tissus coronaux VNO
- À l’aide d’une petite spatule, retirez le bloc d’agarose du petit plat dans le couvercle d’une grande boîte de Pétri. Retournez l’agarose à l’envers, en laissant l’extrémité caudale du VNO vers le haut.
- Découpez le bloc en forme pyramidale à l’aide d’un scalpel chirurgical (3-4 mm à la pointe, 8-10 mm en bas). Veillez à ne pas endommager les tissus incrustés.
- Utilisez de la super colle pour fixer le bloc en forme de pyramide au centre de la plaque d’échantillon du vibratome et attendez ~1 min pour que la colle sèche complètement.
- Transférez la plaque d’échantillon dans la chambre de tranchage et préparez le deuxième VNO en conséquence. Maintenir une plaque avec le deuxième échantillon à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
- Utilisez un microtome à lame vibrante avec les réglages suivants : épaisseur : 150-200 μm ; vitesse : 3,5 u.a. = 0,15 mm/s ; fréquence : 7,5 u.a. = 75 Hz. Transférez les tranches dans une chambre d’oxygénation jusqu’à utilisation après avoir brièvement inspecté la morphologie de la tranche au microscope de dissection. Les tranches peuvent être conservées pendant plusieurs heures.
