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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
REMARQUE : Brièvement, les fibroblastes ont été reprogrammés en iPSC via une reprogrammation génétique basée sur l’ARNm. Les iPSC ont été maintenues dans un milieu de cellules souches (SCM) (voir la liste des matériels) et stockées à une densité de ~1,2 x 102 cellules/mL avec 1 mL de SCM, 10 μM avec l’inhibiteur de protéine kinase rho-associé (ROCKi) Y-27632 et 10 % (v/v) de sulfure de diméthyle (DMSO), dans des flacons cryoconservés dans de l’azote liquide à -160 °C. Toutes les procédures suivantes ci-dessous sont effectuées dans une enceinte de biosécurité, sauf indication contraire.
1. Dilution de la matrice de la membrane basale et revêtement de la plaque
- Matrice de membrane basale réduite à facteur de croissance dilué (1:50) purifiée de la tumeur Engelbreth-Holm-Swarm dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) sans rouge de phénol.
- Enduire les plaques de culture cellulaire de la quantité appropriée de matrice de membrane basale diluée (c.-à-d. plaque à 6 puits = 1 ml, plaque à 12 puits = 0,5 ml) et incuber ces plaques à 37 °C pendant au moins 1 heure.
2. Maintenance des cellules souches pluripotentes induites (iPSC)
REMARQUE : La confluence maximale par puits dans une plaque à fond plat à 6 puits est de ~1,2 x 106 cellules.
- Décongelez les iPSC cryoconservés dans un SCM avec 10 μM Y-27632 et déposez la plaque sur une plaque à 6 puits recouverte d’une matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit.
- Maintenir les iPSC dans la SCM avec 10 μM Y-27632 pendant les premières 24 heures après la décongélation. Passez au milieu frais après 24 heures.
- Maintenir les iPSC dans la SCM jusqu’à ce que les cellules atteignent 80-90 % de confluence avant le passage.
- Calculez le nombre d’iPSC nécessaires à la différenciation en multipliant la densité souhaitée pour la différenciation (15 600 cellules/cm2) par la surface du puits. Pour une plaque à fond plat à 6 puits, multipliez 15 600 cellules/cm2 par 9,6 cm2 pour un total de 149 760 cellules/puits.
- Pour passer, lavez les cellules avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBBS). Ensuite, incubez les cellules avec de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) non enzymatique (voir liste des matériaux) pendant 5 minutes à 37 °C.
- Utilisez un grattoir cellulaire pour soulever doucement les cellules. Prélever des cellules dans du SCM frais.
- Placez les cellules sur des plaques de culture cellulaire recouvertes de SCM dilué et conservez les cellules comme décrit à l’étape 2.3 ou stockez-les à ~1,2 x 106 cellules/mL dans 1 mL de SCM, 10 μM Y-27632 et 10 % de DMSO (v/v) dans des flacons cryoconservés dans de l’azote liquide à une température de -160 °C.
3. Différenciation des iPSC en BMEC
REMARQUE : L’EDTA non enzymatique sépare les cellules en amas. L’EDTA enzymatique (voir tableau des matériaux) sépare les cellules en suspension unicellulaire. L’acide rétinoïque (AR) doit être protégé de la lumière.
- Lavez les iPSC une fois avec le tampon salin de phosphate de Dulbecco (DPBS). Incuber avec de l’EDTA enzymatique (1 mL pour une plaque à 6 puits, 0,5 mL pour une plaque à 12 puits et 0,25 mL pour une plaque à 24 puits) pendant environ 5 minutes à 37 °C pour obtenir une suspension à cellule unique.
- Prélever les cellules et centrifuger à 300 x g (force centrifuge relative) pendant 5 minutes à température ambiante. Mettre en suspension des pastilles de cellules dans un SCM contenant 10 μM Y-27632.
- Déterminez la densité cellulaire à l’aide de Trypan Blue et d’un compteur de cellules automatisé ou d’un appareil d’hémocytomètre. Cellules sur plaque à une densité de 15 600 cellules/cm2 ou 149 760 cellules/puits d’une plaque à fond plat à 6 puits (d’une surface de 9,6 cm2/puits) dans un SCM contenant 10 μM d’Y-27632 pendant 24 heures.
- Initiez la différenciation après 24 heures en remplaçant le SCM par le support E6. Changez E6 medium tous les jours pendant les 4 prochains jours.
- Au jour 4 de la différenciation, remplacer le milieu E6 par un milieu sans sérum endothélial humain (hESFM) complété par un supplément de B27 dilué (1:200), un facteur de croissance des fibroblastes basiques de 20 ng/mL (bFGF) et un RA de 10 μM. Ne changez pas ce support pendant les 48 prochaines heures.
- Préparez 200 ml de hESFM avec de la B27 diluée (1:200), mélangez 1 ml de supplément de B27 50x concentré à 199 ml de hESFM.
- Préparez 20 ng/mL de bFGF en reconstituant 50 μg de bFGF dans 250 μL de tampon Tris (5 mM de Tris, pH 7,6, 150 mM, chlorure de sodium, NaCl) pour obtenir une solution mère de 200 μg/mL. Préparez 200 mL de hESFM contenant 20 ng/mL de bFGF en mélangeant 20 μL de 200 μg/mL de bFGF avec 200 mL de hESFM.
- Préparez 10 μM d’AR en préparant d’abord une solution mère de 40 mg/mL d’AR en ajoutant 2,5 mL de DMSO à 100 mg de poudre d’AR. Diluer cette concentration à 3 mg/mL pour obtenir une solution mère de 10 mM. Préparez 200 mL de hESFM contenant 10 μM d’AR en mélangeant 200 μL d’AR 10 μM dans 200 mL de hESFM.
4. Enrobage de la matrice de collagène IV (COL4) et de fibronectine (FN) pour la purification de BMEC dérivé d’iPSC
- Ajouter 2 mL d’eau stérile à 2 mg de FN pour obtenir une solution mère de FN de 1 mg/mL. Ajouter 5 mL d’eau stérile à 5 mg de COL4 pour obtenir une solution mère de COL4 à 1 mg/mL.
- Laisser le FN se dissoudre pendant au moins 30 minutes à 37 °C et le COL4 se dissoudre à température ambiante.
- Diluer la solution mère de FN dans de l’eau stérile jusqu’à une concentration finale de 100 μg/mL et la solution mère de COL4 jusqu’à une concentration finale de 400 μg/mL.
- Enduire les plaques souhaitées (plaque à 6 puits = 1 mL de solution COL4/FN, plaque à 12 puits = 0,5 mL, plaque à 24 puits = 0,25 mL et plaque filtrée à 12 transpuits = 0,25 mL) avec le mélange de 400 μg/mL de COL4 et de 100 μg/mL de FN.
- Incuber les plaques pendant au moins 2 heures ou toute la nuit à 37 °C ; pour les plaques filtrées Transwell, un minimum de 4 heures est recommandé.
5. Sous-culture et purification de BMEC dérivées d’iPSC
REMARQUE : L’incubation avec l’EDTA enzymatique peut durer plus de 15 minutes en fonction de la confluence des cellules au 6e jour de différenciation.
- Au 6e jour de la différenciation, laver les cellules deux fois avec DPBS. Incuber avec 1 mL d’EDTA enzymatique pendant au moins 15 minutes à 37 °C jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire.
- Prélever les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Mettez en suspension les pastilles cellulaires avec de l’ESEh frais avec un supplément de B27 dilué (1:200), 20 ng/mL de bFGF et 10 μM d’AR.
- Cellules d’amorçage sur des plaques enrobées d’un mélange de 400 μg/mL de COL4 et de 100 μg/mL de FN. Cellules d’amorçage à l’aide d’un rapport de 1 puits d’une plaque de 6 puits à 3 puits d’une plaque de 12 puits, de 3 puits d’une plaque filtrée à 12 transpuits ou de 6 puits d’une plaque de 24 puits.