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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Configuration du matériel
- Incuber les œufs de poussin dans un incubateur d’œufs de table disponible dans le commerce à 37 °C. Incuber les œufs pendant 7 jours pour les embryons E7.
- Préparer des réseaux multi-électrodes (MEA). Stérilisez le nombre requis d’AEM en les trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant 3 à 4 h, puis en les rinçant trois fois dans environ 10 ml d’eau distillée stérile dans la hotte de niveau de biosécurité II (BSLII).
note: Les MEA contiennent 64 électrodes de platine nanoporeuses disposées dans une grille de 8 x 8. Le diamètre des électrodes est de 30 μm et l’espacement entre les électrodes est de 200 μm. N’utilisez pas d’éthanol dénaturé pour stériliser les AEM, car cela entraînerait de la corrosion.
- Placez les AEM dans un récipient stérile avec un couvercle (pour maintenir des conditions de stérilité) et déplacez-les dans un incubateur de table. Cuire au four pendant au moins 6 heures à 55 °C. Cette étape est essentielle pour une bonne stérilisation, et la température ne doit pas dépasser 60 °C. Pour maintenir la stérilité, placez la parabole contenant les MEA dans la hotte BSLII pour la ranger jusqu’à une utilisation ultérieure.
note: Nous utilisons un plat de cuisson en verre allant au four avec un couvercle en plastique et le stérilisons en surface avec de l’éthanol à 70 % et le plaçons dans la hotte BSLII pour le séchage.
- Aliquote la solution de matrice extracellulaire (ECM). Décongeler le flacon à 4 °C pendant la nuit et congeler 100 μL d’aliquotes à -20 °C.
note: L’ECM est expédié congelé. Il ne doit pas être amené à température ambiante avant d’être prêt à être enrobé car il polymérise à température ambiante et est impossible à enrober une fois polymérisé. La MEC sans facteurs de croissance est préférable pour prévenir des effets supplémentaires dus à des facteurs inconnus.
- Stérilisez tous les instruments de dissection (pinces Dumont #5, pinces courbes, petits ciseaux et ciseaux à ressort) et les boîtes de dissection recouvertes d’un matériau auto-obturant avec de l’éthanol à 70 % et laissez-les sécher dans la hotte de dissection.
2. Culture de neurones embryonnaires de poussin et activité du réseau
- Le jour du placage, retirez un flacon d’ECM du congélateur à -20 °C, vaporisez de l’éthanol à 70 % et placez-le sur de la glace. Diluer à 25 % en ajoutant 300 μL de milieu neurobasal froid à l’intérieur de la hotte BSLII.
- À l’aide d’une pipette P200, ajoutez 100 μL d’ECM à 25 % au centre du MEA en prenant soin de ne pas toucher les électrodes et retirez-les immédiatement en laissant une fine pellicule sur la surface. Couvrez le MEA et placez-le dans l’incubateur de CO2 (37 °C et 5 % de CO2) jusqu’à ce qu’il soit prêt à plaquer les neurones.
- Stérilisez la coquille externe d’un œuf E7 (jour embryonnaire 7, incubé à 37 °C pendant 7 jours) avec de l’éthanol à 70 %. Décapitez l'embryon dans une boîte de dissection par fond Sylgard contenant une solution de sels équilibrés de Hank (HBSS) froide et stérile sans calcium. Coupez autour des yeux et retirez les globes oculaires. À l’aide d’une pince fine DuMont #5 et de ciseaux à ressort, faites une incision sur le côté ventral et retirez les couches externes de la peau pour exposer le cerveau antérieur et le tectum optique. Pelez et retirez soigneusement la membrane piale. Transférez le cerveau antérieur dans une autre boîte de Pétri et coupez-le en petits morceaux d’environ 2 mm avec des ciseaux à ressort.
note: Il ne devrait pas y avoir de vaisseaux sanguins attachés au cerveau antérieur après l’ablation de la membrane piale. Si possible, il est préférable d’effectuer la dissection dans une hotte de dissection stérile, bien que nous ayons obtenu d’assez bons résultats lorsque la dissection est effectuée à l’extérieur d’une hotte à condition que les instruments et la zone de dissection soient soigneusement stérilisés avec de l’éthanol à 70 %.
- À l’aide d’une pipette de transfert stérile, prélever les morceaux de cerveau antérieur dans un tube à centrifuger de 15 ml et retirer la plus grande quantité possible de HBSS après les avoir laissés couler au fond du tube à centrifuger.
- Ajouter 1 mL de trypsine/éthylènediamine tétraacétique à 0,05 % (trypsine/EDTA) (préchauffé à 37 °C) et incuber à 37 °C pendant 15 minutes.
- À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever délicatement la trypsine sans déranger les morceaux de tissu et ajouter 1 mL de milieu neurobasal. Laissez les morceaux de tissu couler au fond et retirez le milieu. Répétez ce lavage une fois de plus. Cette étape consiste à éliminer la trypsine/EDTA.
- Ajouter 2 ml de milieu neurobasal et commencer à triturer. La trituration consiste à prendre une pipette Pasteur stérile polie au feu et à y passer doucement le tissu plusieurs fois jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de morceaux. S’il reste des morceaux après des passages répétés, laissez-les simplement se déposer au fond.
note: Évitez de mousser pendant la trituration - si de la mousse se forme, arrêtez-la et retirez-la par aspiration.
- Diluez les cellules remises en suspension à l’échelle 1:10 avec un milieu neurobasal et comptez les cellules viables à l’aide du colorant Trypan Blue et d’un hémocytomètre. Mélanger 50 μL des cellules diluées avec 50 μL de solution de Trypan Blue dans un tube à centrifuger de 0,5 mL. Ajoutez 10 μL à l’hémacytomètre après l’avoir placé sur la lamelle et comptez les cellules claires brillantes (les cellules bleues sont mortes et ne doivent pas être comptées).
note: Le nombre typique de cellules d’un seul tectum optique E7 varie entre 1 et 5 x 107 cellules/ml.
- Plaquez les cellules dissociées sur des MEA revêtus d’ECM à une densité de 2 200 cellules/mm carré. Pour notre système MEA, cela se traduit par environ 130 000 cellules par MEA. Ajouter le milieu neurobasal pour porter le volume de l’AEM à 1 mL et placer les AEM dans l’incubateur de CO2 pendant la nuit pour l’attachement cellulaire et l’extension des neurites (Figure 1).
note: Pour les AEM de différentes zones et de différents nombres d’électrodes, différentes densités de cellules pourraient être testées - en général, une densité cellulaire plus élevée entraîne une plus grande activité du réseau, mais conduit également à des cultures à durée de vie plus courte.
