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1. Génération de cellules progénitrices neurales dérivées d’iPSC (iNPC)
- Produire des EZ-spheres à partir de colonies d’iPSC comme décrit ci-dessous et comme publié précédemment.
- Cultiver des colonies d’iPSC jusqu’à la confluence sur des plaques à 6 puits recouvertes d’une matrice basale (0,5 mg/plaque) dans mTESR1 ou d’autres milieux commerciaux (voir le tableau des matériaux).
- Retirer le milieu iPSC et le remplacer par 2 mL de milieu EZ-sphere [ESM ; DMEM :F12 7:3 complété par 100 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF), 100 ng/mL de facteur de croissance épidermique, 5 μg/mL d’héparine et 2 % de supplément de B27].
- Racler le fond de chaque puits confluent avec le dos d’une pointe de pipette stérile de 1000 μL ou d’un grattoir à cellules.
- Collectez toutes les cellules et placez-les dans une fiole T25 à très faible allongement pour permettre la formation spontanée de sphères flottantes. Incuber toute la nuit à 37 °C.
- Nourrissez les sphères tous les 2 à 3 jours lorsque le milieu jaunit en remplaçant la moitié du milieu par de l’ESM frais. Cela permet aux sphères de rester dans un milieu conditionné, ce qui est très important pour leur croissance et leur maintien.
- Versez le ballon sur un support tubulaire et laissez les sphères se déposer par gravité pendant 1 à 2 minutes jusqu’au coin du ballon.
- Une fois installé, aspirez la moitié du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL ou 10 mL et remplacez-la par un ESM frais et préchauffé.
- Passage hebdomadaire des sphères EZ en hachant des sphères à 200 m de diamètre comme décrit précédemment. Les sphères EZ peuvent être maintenues jusqu’à 25 passages et sont idéales lorsqu’elles sont utilisées entre les passages 8 à 25.
- Préparer la suspension unicellulaire d’iNPC :
- Pour induire la différenciation neurale, dissociez la sphère EZ en cellules uniques.
- Récupérez les sphères 3 à 4 jours après les avoir hachées dans une fiole T75 et transférez-les dans un conique de 15 ml, puis laissez-le reposer pendant 2 minutes ou jusqu’à ce que toutes les sphères se déposent au fond.
- Retirez lentement l’ESM à l’aide d’une pipette de 5 mL sans perturber les sphères décantées. Ajouter 1 mL de solution de dissociation (voir le tableau des matières) et incuber pendant 10 min à 37 °C.
- Agitez la solution de dissociation et les sphères après 5 min d’incubation pour vous assurer que toutes les sphères stabilisées sont traitées.
- Retirez lentement la solution de dissociation. Ajouter 1 mL de milieu de différenciation neurale [NDM ; DMEM : F12 avec 2 % de B27 moins vitamine A, 1 % de supplément de N2 et facteur neurotrophique dérivé du cerveau humain (hBDNF, 20 ng/mL)].
- Triturez les sphères en cellules individuelles en pipetant à l’aide d’une pipette de 1 mL suivie d’une pipette de 200 μL, jusqu’à ce que toutes les sphères se soient dissociées. Évitez la formation de bulles pendant la procédure de trituration.
- Compter les cellules dissociées à l’aide d’un hémocytomètre et diluer les cellules jusqu’à une densité finale de 1 x 106 cellules/mL. Il est possible de modifier la densité en fonction de l’application.
note: Des densités plus élevées (jusqu’à 6 x 106 cellules/mL) sont recommandées pour les cultures à court terme d’une durée maximale de 3 jours, et des densités plus faibles sont recommandées pour des applications à long terme allant jusqu’à 3 semaines.
note: Les cellules sont maintenant prêtes à s’ensemencer dans le canal supérieur de la puce pour former le « côté cerveau ».
2. Différenciation des iPSC en iBMEC
- Passage des iPSC d’un seul puits confluent d’une plaque à 6 puits dans un rapport de 1:6 dans une plaque à membrane basale à 6 puits recouverte d’une matrice. Laissez les cellules adhérer pendant 24 h. Changez le support iPSC tous les jours.
- Comptez les cellules quotidiennement à l’aide d’un hémocytomètre.
- Lorsque les cellules atteignent une densité de 1,5 à 3,0 x 105 cellules/puits, remplacez le milieu iPSC par 3 ml de milieu non conditionné sans bFGF [DMEM :F12 1:1, avec 10 % de remplacement sérique knockout (KOSR), 1 % d’acides aminés non essentiels (NEAA), 0,5 % de supplément de glutamine (Table des matériaux) et 100 μM β-mercaptoéthanol]. Remplacer le moyen tous les jours pendant 6 jours.
- Au jour 6, remplacer le milieu par un milieu de cellules endothéliales (CE) [milieu libre sérique endothélial humain (hESFM) complété par 1 % de sérum bovin dérivé du plasma pauvre en plaquettes, 20 ng/mL de bFGF et 10 μM d’acide rétinoïque (AR) tout-trans)]. Laisser mi-cuire pendant 2 jours.
- Retirer le milieu EC et ajouter 1 mL de solution de dissociation par puits. Incuber à 37 °C pendant 35 min
note: Bien que cela soit considéré comme une longue période d’incubation dans la solution de dissociation utilisée ici, les iBMEC peuvent supporter ce traitement avec une viabilité cellulaire supérieure à 90 %.
- Détachez les cellules du puits en pipetant doucement la suspension cellulaire et en recueillant toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml.
note: Évitez le pipetage brutal. Si les cellules ne se détachent pas facilement, incuber pendant 5 minutes supplémentaires.
- Ajouter 1 volume de milieu EC dans le conique de 15 mL pour inactiver l’accutase, centrifuger à 200 x g pendant 5 min, retirer le milieu et le remplacer par 1 mL de milieu EC (sans bFGF ni RA).
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajuster la densité cellulaire à 14–20 x 106 cellules/mL.
note: Les cellules sont maintenant prêtes à être ensemencées dans le canal inférieur de la puce pour former le « côté sang ».
3. Microfabrication de la puce d’organe
- Utilisez une puce d’orgue pour le modèle de puce BBB et sa production comme fait précédemment. La puce d’organe à canal haut (voir le tableau des matériaux) est fabriquée à partir d’un élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) hautement flexible qui contient deux canaux micro-échelles superposés et parallèles séparés par une membrane poreuse flexible. Les tailles supérieure et inférieure des microcanaux sont respectivement de 1 mm x 1 mm et de 1,0 mm x 0,2 mm. Les deux canaux sont séparés par une membrane poreuse flexible de 50 m d’épaisseur, contenant des pores de 7 m de diamètre avec un espacement de 40 m. La surface de la membrane poreuse qui sépare les canaux est de 0,171cm2.
4. Préparation des copeaux
- Les copeaux d’organe sont fournis préemballés dans le support de puce, éliminant ainsi le besoin de perturber ou de déformer l’alignement de la puce lors de la manipulation. De plus, le support de puce se connecte en toute sécurité à un module portable (« Pod ») qui sert d’interface entre le module de culture et la puce.
- Vaporisez l’emballage des puces avec de l’éthanol à 70 % et apportez-les dans l’enceinte de biosécurité (BSC).
- Ouvrez l’emballage et disposez la puce d’organe dans une boîte de Pétri stérile. Manipulez le support de copeaux uniquement par les côtés pour éviter tout contact direct avec la puce.
- Assurez-vous que la languette du support est orientée vers la droite (Figure 1) et, si vous utilisez plusieurs puces, alignez-les toutes dans la même orientation.
- Étiquetez chaque puce sur l’onglet du support (la préparation complète de la puce et le flux de travail sont illustrés à la Figure 2).
5. Activation de surface et revêtement ECM
- Préparation de la solution d’activation de surface
- Le réactif d’émulation 1 (ER-1), fourni dans un flacon contenant 5 mg, est sensible à la lumière. Préparez une solution fraîche d’ER-1 immédiatement avant utilisation. L’intégrité de l’ER-1 est cruciale pour la bonne préparation des puces.
- Éteindre la lumière dans le BSC lors de la manipulation de ER-1.
note: ER-1 est un irritant oculaire et doit être manipulé à l’ESB avec des gants et une protection oculaire appropriés.
- Laissez les réactifs ER-1 et ER-2 s’équilibrer à température ambiante (RT) avant utilisation.
- Protégez la solution de la lumière en enveloppant un tube conique stérile vide de 15 ml avec du papier d’aluminium.
- Dans le BSC, tapotez brièvement le flacon ER-1 pour déposer la poudre au fond.
- Ajoutez 1 mL de tampon ER-2 dans le flacon et transférez immédiatement son contenu au fond du tube conique enveloppé de 15 mL. Ne pas pipeter pour mélanger. La couleur de la solution transférée dans le tube conique sera rouge.
- Répétez l’étape 5.1.6 3 fois. Lors du dernier tour, bouchez le flacon ER-1 et retournez-le pour recueillir la poudre restante du couvercle, puis transférez la solution dans le tube conique ; cela portera le volume total à 4 mL de solution ER-1.
- Ajouter 6 mL de solution ER-2 aux 4 mL de solution ER-1 dans le tube conique de 15 mL jusqu’à une concentration finale de 0,5 mg/mL. ER-1 doit être complètement dissous dans la solution ER-2.
- Activation de surface
- À l’aide d’une pipette P200 et d’une pointe de pipette filtrée stérile de 200 μL, prélevez 200 μL de mélange ER-1.
- Placez la pipette dans l’entrée inférieure et poussez 20 μL de mélange ER-1 à travers le canal inférieur jusqu’à ce que le mélange commence à s’écouler par la sortie du canal inférieur.
- Ajoutez environ 50 μL de mélange ER-1 et placez-le dans l’entrée du canal supérieur. Poussez le mélange à travers le canal supérieur jusqu’à ce qu’il commence à s’écouler par la sortie du canal supérieur.
- Retirez tout l’excès de mélange ER-1 de la surface de la copeau par aspiration douce. Assurez-vous que le mélange ER-1 n’est retiré que de la surface de la copeau et non des canaux.
- Vérifiez que les canaux sont exempts de bulles d’air avant l’activation des rayons ultraviolets (UV). Si des bulles d’air sont détectées, éliminez les bulles en lavant le canal avec le mélange ER-1.
- Placez le plat ouvert contenant les chips dans la boîte à lumière UV (fournie par Emulate Inc.).
- Réglez l’interrupteur à l’arrière du caisson de lumière UV sur le réglage « Cohérent ». Mettez l’appareil sous tension et lancez l’activation UV. Laissez les copeaux sous la lumière UV pendant 20 min.
note: Évitez d’exposer le personnel à la lumière UV.
- Retirez le mélange ER-1 des deux canaux.
- Laver chaque canal avec 200 μL de solution ER-2.
- Retirez ER-2 des deux canaux.
- Lavez chaque canal avec 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) stérile et froide.
- Laissez les DPBS froids à l’intérieur des canaux jusqu’à ce que vous passiez à l’étape suivante.
- Préparation et enrobage de matrice extracellulaire (ECM)
- Préparez la solution ECM en combinant les composants ECM individuels avec du DPBS froid, de l’eau ou un autre solvant jusqu’aux concentrations de travail finales. La solution ECM doit être préparée fraîche à chaque utilisation.
- Enduire les canaux supérieur et inférieur de la puce avec ECM, avec la composition déterminée par le type de cellule à ensemencer. Le mélange ECM doit être maintenu sur de la glace jusqu’à l’utilisation.
- Utilisez de la laminine (50 μg/mL) pour enrober le « côté cerveau », et du collagène IV et de la fibronectine mélangés dans un rapport de 4:1 (320:80 μg/mL) pour enrober le « côté sang » comme décrit à la rubrique 5.6.
- Préparation des aliquotes ECM
- Diluer 1 mg/mL de laminine dans du DPBS froid jusqu’à une concentration finale de 50 μg/mL. Aliquote et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
- Dissoudre le collagène IV dans de l’acide acétique à 0,1 % jusqu’à une concentration de 1 mg/mL. Incuber la solution à 2-8 °C pendant la nuit ou à RT pendant 1 à 3 h ou jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
- Préparez un mélange de 1 mL de collagène IV : fibronectine (320 μL de collagène IV, 80 μL de fibronectine, 600 μL de H2O stérile doublement distillé). Le mélange peut être conservé à -20 °C.
- Revêtement des copeaux avec ECM
- Aspirez complètement le DPBS froid des deux canaux. Réglez une pipette P200 pour prélever 100 μL de solution de collagène IV :fibronectine.
- Introduisez la solution par l’entrée du canal inférieur jusqu’à ce qu’une petite gouttelette se forme sur la sortie. Laissez une petite gouttelette sur l’entrée après avoir retiré la pointe de la pipette.
- Introduisez la solution de laminine par l’entrée du canal supérieur jusqu’à ce qu’une petite gouttelette se forme sur la sortie. Laissez une petite gouttelette sur l’entrée après avoir retiré la pointe de la pipette.
- Regardez attentivement les canaux pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles. S’il y a des bulles, lavez le canal avec la solution ECM appropriée jusqu’à ce que toutes les bulles soient éliminées.
- Répétez les étapes 5.5.1 à 5.5.4 pour chaque jeton.
- Ajoutez 1,5 mL de DPBS dans le capuchon d’un tube conique de 15 mL. Placez le capuchon DPBS dans la boîte de culture de 150 mm avec les copeaux pour fournir une humidité supplémentaire et scellez la boîte avec du parafilm. Pour de meilleurs résultats, incubez les copeaux à 4 °C pendant la nuit.
note: Si vous le souhaitez, les cellules peuvent être ensemencées le même jour que l’activation de la puce et le revêtement ECM, bien que l’incubation pendant la nuit soit préférée. Les copeaux peuvent être prêts à être semés 4 h après l’ajout de l’ECM et l’incubation des copeaux à 37 °C.
6. Ensemencement du canal « côté cerveau » et différenciation des sphères EZ en cultures neuronales mixtes
- Apportez le plat contenant les frites préparées au BSC. Lavez délicatement les deux canaux avec 200 μL de NDM.
- En évitant tout contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes de support en excès de la surface de la puce. Agitez doucement la suspension cellulaire avant l’ensemencement de chaque copeau pour assurer une suspension cellulaire homogène
- Amorcer les iNPC dans le canal supérieur pour générer le « côté cerveau »
- Ensemencez les cellules (1 x 106 cellules/mL) dans le canal supérieur de la puce. Ajoutez une pointe P200 contenant 30 à 100 μL de suspension cellulaire à l’entrée du canal supérieur et relâchez doucement la pointe de la pipette. Prenez une pipette P200 vide, appuyez sur le piston, insérez-la dans la sortie du canal supérieur et tirez délicatement la suspension à cellule unique à travers la puce.
- Couvrez la boîte et transférez-la au microscope pour vérifier la densité d’ensemencement et la distribution homogène des cellules dans le canal supérieur. Retirez délicatement la pointe de la pipette des orifices d’entrée et de sortie de la puce.
- La densité de semis doit apparaître à 20 % de couverture. Si la densité de semis est supérieure ou inférieure à celle prévue ou inégale, retournez les copeaux dans l’ESB, lavez le canal 2 fois avec 200 μL de milieu frais et répétez l’étape 6.3.1.
- Après avoir confirmé la densité cellulaire correcte, placez immédiatement les copeaux dans l’incubateur pendant 2 h à 37 °C après l’ensemencement de chaque lot de copeaux. Lavez les cellules qui ne se fixent pas avec du NDM frais.
- Maintenir les cellules dans des conditions statiques à 37 °C avec un remplacement quotidien du NDM pendant au moins 48 h avant d’amorcer l’écoulement. Les iBMEC peuvent être ensemencés après la fixation des iNPC ou le jour suivant l’ensemencement des iNPC.
7. Ensemencement des iBMEC dans le canal inférieur pour générer le « côté sang »
- Apportez le plat contenant les frites préparées au BSC. Lavez délicatement le canal inférieur avec 200 μL de fluide EC.
- En évitant le contact avec les ports, aspirez soigneusement les gouttelettes de fluide EC en excès de la surface de la puce, en veillant à laisser du fluide dans les deux canaux. Agitez doucement la suspension cellulaire avant de semer chaque copeau pour assurer une suspension cellulaire homogène.
- À l’aide d’une pipette P200, prélevez 30 à 100 μL de suspension de cellules iBMEC (14 à 20 x 106 cellules/mL) et placez l’embout dans l’entrée du canal inférieur. Débranchez doucement l’embout de la pipette, en laissant l’embout contenant la cellule dans l’orifice d’entrée.
- Appuyez sur le piston d’une pipette P200 avec une pointe vide, insérez-la dans la sortie du canal inférieur et tirez avec précaution la suspension unicellulaire à travers le canal inférieur en relâchant lentement le piston de la pipette.
- Aspirez l’excès de suspension cellulaire de la surface de la puce. Évitez tout contact direct avec les orifices d’entrée et de sortie pour vous assurer qu’aucune suspension de cellule n’est aspirée hors des canaux.
- Couvrez la puce et transférez-la au microscope pour observer la densité de semis. Le canal inférieur doit être rempli sans espace observable entre les cellules lorsqu’elles sont observées à 4x ou 10x au microscope (Figure 3).
- Si la densité d’ensemencement est inférieure à 90 % ou si elle est répartie de manière inégale, ajustez la densité cellulaire en conséquence et répétez les étapes 7.2 à 7.6 jusqu’à ce que la densité correcte soit atteinte dans le canal. Après avoir confirmé la densité cellulaire correcte (Figure 3), ensemencez les cellules dans les puces restantes. Pour fixer des cellules sur la membrane poreuse, située en haut du canal inférieur, inversez chaque puce et posez-la dans un berceau à puces.
- Placez un petit réservoir (capuchon de tube conique de 15 ml contenant du DPBS stérile) à l’intérieur de la boîte de 150 mm pour fournir de l’humidité aux cellules. Incuber les copeaux à 37 °C pendant environ 3 h, ou jusqu’à ce que les cellules du canal inférieur se soient fixées. Une fois que les iBMEC se sont fixés (~3 h après l’ensemencement), retournez les copeaux en position verticale pour permettre la fixation de la cellule à la partie inférieure du canal inférieur.
8. Initiation du flux
- L’écoulement est généralement amorcé 48 h après l’ensemencement des iBMEC. Ce temps est nécessaire pour que les iBMEC se fixent fermement à la puce.
- Pour maintenir le flux laminaire à travers la puce, il est important de dégazer et d’équilibrer la température du fluide. Le milieu doit être préchauffé dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h.
- Jusqu’à 50 ml de milieu chauffé peuvent être dégazés par incubation sous un système de filtration sous vide pendant 15 min.
- Amorçage de modules portables
- Désinfectez l’extérieur de l’emballage et des plateaux du module portable avec de l’éthanol à 70 %, essuyez-le et transférez-le à l’ESB. Ouvrez l’emballage et placez les modules dans le plateau. Orientez-les avec les réservoirs vers l’arrière du plateau.
- Pipeter 3 mL de milieu chaud pré-équilibré dans chaque réservoir d’entrée. Ajouter du milieu de culture EC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur et du NDM dans le réservoir d’entrée du canal supérieur (figure 4).
- Pipeter 300 μL de milieu chaud pré-équilibré dans chaque réservoir de sortie, directement au-dessus de chaque orifice de sortie (Figure 4).
- Placez jusqu’à six modules portables sur chaque plateau. Amenez les plateaux dans l’incubateur et glissez-les complètement dans le module de culture avec la poignée du plateau vers l’extérieur.
- Sélectionnez et exécutez le cycle « Prime » sur le module de culture. Fermez la porte de l’incubateur et laissez le module de culture amorcer les modules portables (cela prend ~1 min). Le cycle d’amorçage est terminé lorsque la barre d’état indique « Prêt ». Retirez le plateau du module de culture et apportez-le à l’ESB.
- Vérifiez que les modules portables ont été amorcés avec succès en inspectant la face inférieure de chaque module portable dans l’ESB. Recherchez la présence de petites gouttelettes aux quatre ports.
- Si aucun module portable ne présente de gouttelettes, relancez le cycle d’amorçage sur ces modules. Si un fluide a coulé sur le plateau (cela peut se produire plus souvent par les orifices de sortie), nettoyez le plateau avec de l’éthanol à 70 %.
- Connexion de puces à des modules portables, régulation et initiation de l’écoulement
- Lavez délicatement les deux canaux de chaque puce avec un milieu de culture chaud et équilibré spécifique à la cellule pour éliminer toute bulle possible dans le canal et placez de petites gouttelettes de milieu (en fonction du milieu dans le canal) sur le dessus de chaque orifice d’entrée et de sortie.
- Insérez des puces avec des supports dans les modules portables et placez-en jusqu’à six sur chaque plateau. Insérez les plateaux dans le module de culture. Programmez les conditions appropriées de culture de puces d’organes (débit et étirement) sur le module de culture.
Les - conditions programmées commenceront dès que le cycle « Réguler » sera terminé.
note: Les débits de chaque canal peuvent être contrôlés indépendamment et peuvent être réglés à des débits allant de 0 à 1 000 μL/h. La puce BBB est généralement cultivée à 30 μL/h. Lors de l’écoulement de fluides tels que les fluides EC ou ESM à 30 μL/h et 1000 μL/h, les forces de cisaillement sont respectivement de 0,01 dyn/cm2 et 0,33 dyn/cm2.
- Exécutez le cycle « Réguler », qui dure environ 2 h, après quoi le module de culture commencera à s’écouler dans les conditions de culture de puces d’organes prédéfinies.
