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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Microdissection du télencéphale dorsolatéral
- Préparez le milieu de dissection (100 ml) : 98,5 mL de solution saline équilibrée de Hank's (HBSS), 0,5 mL de 5 M d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) pH 7,4, 1 mL de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/mL et 10 000 μg/mL).
- Filtrez et stérilisez le milieu de dissection.
- Prélever les embryons embryonnaires du jour 14 (E14) d’une souris enceinte C57/Bl6 (Mus musculus) sous anesthésie à l’isoflurane.
note: Considérez E0 comme le jour de la détection du bouchon vaginal. La dissection doit être terminée au plus tard 1 h après le retrait de la souris gravide. Ce protocole s’applique également aux embryons E11-E17.
- Retirer les embryons par hystérectomie dans des conditions stériles.
- Transférez les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu de dissection froid (4 °C).
- Retirez la cervelle du crâne en coupant le long de la fissure longitudinale. Le nombre d’embryons varie généralement de cinq à dix. Chaque cerveau E14 produit environ 2 x 106 cellules, y compris les progéniteurs et les neurones postmitotiques (rapport 1:1)
note: Utilisez le stéréomicroscope pour les étapes suivantes.
- Retirez les méninges à l’aide d’une pince à dissection. Fendez le télencéphale en deux pour séparer les hémisphères. Pour isoler le télencéphale dorsolatéral, coupez le long de la courbe dorsomédiale et de la limite palliale-sous-palliale à l’aide d’une pince à dissection. Transvasez le télencéphale dorsolatéral dans un tube de 2 mL avec un milieu de dissection froid (4 °C) jusqu’à ce que tous les cerveaux soient disséqués.
2. Dissociation cellulaire et placage
- Préparez le milieu de prolifération (50 ml de DMEM + 10 % de FCS) : 44 ml de milieu d'aigle modifié Dulbecco (DMEM), 5 ml de sérum de veau fœtal (SCF), 0,5 ml de glucose à 40 %, 0,5 ml de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/ml et 10 000 μg/ml). Filtrez et stérilisez le milieu de prolifération.
- Préparez le milieu de différenciation (50 ml de DMEM + 2 % de B27) : 48 ml de DMEM, 1 ml de B27, 0,5 ml de glucose à 40 %, 0,5 ml de pénicilline/streptomycine (10 000 unités/ml et 10 000 μg/mL). Filtrez-stérilisez le milieu de différenciation.
- Après une micro-dissection du télencéphale dorsolatéral de souris E14, centrifuger le tube avec le tissu collecté et le milieu de dissection à froid (pendant 5 min à 4 °C, 340 x g) pour précipiter le tissu.
- Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 1 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) préchauffé (37 °C) (0,05 %) pour la digestion chimique. Incuber pendant 15 min à 37 °C. Ajouter 2 mL de milieu de prolifération pour arrêter l’activité de la trypsine.
- Polissez l’extrémité d’une pipette Pasteur en verre sur un brûleur à gaz ou un bec Bunsen pendant quelques secondes pour réduire légèrement l’ouverture. Lavez la pipette en aspirant le FCS pour enrober l’embout. Pour éviter les bulles, dissociez mécaniquement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur polie au feu et recouverte de FCS.
- Centrifuger les cellules (pendant 5 min à 4 °C, 340 x g). Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Ajouter 1 mL de milieu de prolifération et remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette. Répétez cette étape une fois.
- Préparez une dilution 1:1 de la suspension cellulaire à l’aide d’une solution de bleu trypan à 0,4 %. Les cellules non viables seront bleues. À l’aide d’une chambre de Neubauer, comptez le nombre de cellules viables (non colorées).
- Diluez les cellules dans un milieu de prolifération pour obtenir 10à 6 cellules/mL. Ajouter 500 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits (environ 2,5 × 105 cellules/cm2). Incuber les cellules à 37 °C et 5 % CO2.
note: N’utilisez pas de lamelles en verre, car elles peuvent se déplacer pendant l’expérience et modifier le champ d’observation. Vous pouvez également utiliser des plaques de culture tissulaire à fond de verre.
note: Si vous n’utilisez pas de multi-plats traités pour la culture cellulaire, il est important de prétraiter vos plaques avec du Poly-D-Lysin (50 μg/ml) pendant 2 h à 37 °C. Les plaques traitées au PDL peuvent être stockées à 4 °C après le lavage à l’eau distillée.