Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Collecter des DRG lombaires sur des rats expérimentaux
- Utilisez des rats Sprague-Dawley (SD) âgés de 2 à 3 semaines pour la collecte lombaire de DRG.
REMARQUE : Les neurones DRG prélevés sur des rats âgés de plus de 4 semaines ne se développent pas bien dans les conditions de culture décrites ici.
- Stérilisez tous les instruments chirurgicaux dans un autoclave.
- Anesthésez le rat avec un mélange 1:1 de tilétamine et de zolazépam (20 mg/kg ; injection intrapéritonéale (IP)) et attendez que l’animal ne montre aucune réponse de retrait du pied lors d’un test de pincement des orteils.
note: Différentes stratégies d’anesthésie peuvent être utilisées avec succès dans ce protocole.
- Sacrifiez le rat par décapitation avec une guillotine commerciale.
- Utilisez la guillotine pour isoler le tronc du corps du rat entre le membre antérieur et le fémur. Voir la figure 1A pour un schéma de la région à collecter.
note: La ligne de coupe caudale doit être juste rostrale par rapport au fémur. Le L6 DRG lombaire sera excisé si le site de coupure est trop haut dans la colonne vertébrale.
- Coupez le long du sternum et retirez tous les organes/tissus avec des ciseaux de dissection (Figure 2A-a).
- Coupez le long du côté du tronc pour recueillir la partie dorsale du rat et retirer la peau. Voir la figure 1B pour une photographie du tronc dorsal disséqué.
- Préparez le mouchoir sur de la glace avant de prélever le DRG. Nettoyez la fourrure et le sang des gants et stérilisez-les avec de l’éthanol à 75 % avant de passer à l’étape suivante.
- Retirez les muscles recouvrant la colonne lombaire. Tout d’abord, faites deux coupes le long des côtés de la colonne vertébrale (gauche et droite) et une coupe latérale pour marquer l’extension rostrale de la colonne lombaire. Ensuite, retirez les muscles dorsaux de la colonne vertébrale à l’aide d’une pince à os (Figure 2A-b).
- Retirez la partie dorsale des vertèbres à l’aide d’une pince à os et exposez la moelle épinière.
- Retirez la moelle épinière à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 2A-c) et d’une pince (Figure 2A-d).
- Identifiez le DRG lombaire en comptant les vertèbres à partir de la dernière côte (vertèbre thoracique 13). Voir la figure 1C pour un schéma des positions des vertèbres.
- Prélever le DRG lombaire bilatéral (L1-L6) à l’aide de micro-ciseaux (figures 2A-f) dans une boîte de culture de 35 mm avec 2 ml de milieu glacé sans sérum. Retirez les fibres neuronales (comme indiqué sur la Figure 1C) de la connexion DRG, puis transférez-les dans la boîte de culture pour améliorer la pureté des cultures.
note: Le DRG collecté peut être conservé dans un milieu sur de la glace pendant environ 1 h. Pendant ce temps, plusieurs rats peuvent être euthanasiés pour créer une plus grande réserve de DRG.
2. Culture primaire du bois de rat DRG
REMARQUE : Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte à flux laminaire.
- Préparez un milieu de culture contenant 10 % de sérum fœtal de bovin, 100 mM de pyruvate de sodium et 1 x pénicilline/streptomycine dans 1 x DMEM-F12.
- Enduire la plaque de 24 puits traitée par culture cellulaire avec 200 μg/mL de poly-L-lysine pendant 2 h, puis laver à l’eau stérilisée.
- Pré-incuber la boîte de culture avec 1 mL de milieu de culture dans un incubateur à 37 °C de CO2 avant de l’utiliser pendant au moins 30 min.
- Transvasez le plat de 35 mm contenant du DRG dans un capuchon laminaire et lavez le DRG avec un milieu sans sérum 3 fois à l’aide d’une pipette.
note: L’extérieur du plat doit être nettoyé avec de l’éthanol à 75 % avant de le transférer dans la hotte. La parabole de 35 mm peut contenir des DRG provenant d’un certain nombre de rats (cela dépendra des exigences de la conception expérimentale).
- Placez le DRG (d’un seul rat ou combiné à partir de plusieurs rats) dans une nouvelle boîte de culture de 35 mm, qui contient 2 mL de collagénase de type IA (1 mg/mL dans un milieu sans sérum) à l’aide d’une pince à épiler stérile (Figure 2A-e).
note: La solution de collagénase doit être stérilisée en la faisant passer à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
- Digérer le DRG dans la solution de collagénase dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 30 min.
- Retirer la solution de collagénase et laver le DRG 3 fois dans 2 mL de solution saline équilibrée de Hank's (HBSS).
note: Il peut y avoir des fibres ou des tissus résiduels qui se détachent du DRG dans la solution. Retirez-les à l’aide d’une pipette avec la solution de lavage.
- Ajouter 2 ml de trypsine-EDTA préchauffée à 0,05 % dans la boîte de 35 mm contenant du DRG et digérer le DRG dans un incubateur à 37 °C de CO2 pendant 30 min.
- Transférez les 2 mL de solution contenant du DRG dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’une pipette en verre.
note: Le DRG peut coller à la pipette en verre, cette étape doit donc être effectuée avec soin. La perte de DRG peut être évitée en maintenant la solution contenant du DRG dans l’extrémité conique d’une pipette en verre (environ 0,5 ml) et en transférant la solution dans le tube de centrifugation lentement mais sans pause.
- Centrifuger la solution à 290 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter un autre milieu sans sérum de 2 mL pour remettre le DRG en suspension.
- Répétez l’étape 2.10 2 fois, mais remplacez le milieu sans sérum par un milieu de culture préchauffé la dernière fois.
- Triturer manuellement le DRG environ 60 fois à l’aide d’une pipette Pasteur polie à la flamme (longueur 230 mm et diamètre intérieur de la tête de pointe 1 mm). Voir la figure 2B pour une photographie comparant l’orifice d’une pipette Pasteur polie à la flamme à une pipette non polie.
note: Le diamètre intérieur de la pipette Pasteur polie à la flamme est environ 10 % plus petit que celui de la pipette de contrôle et l’intérieur de l’extrémité effilée doit être plus lisse. Attention à ne pas créer de bulles lors de la trituration des cellules.
- Retirez la parabole enrobée de poly-L-lysine de l’incubateur de CO2. Aspirez le milieu de culture incubé de la boîte et ensemencez les cellules dissociées dans la boîte enrobée.
- Ensemencer les cellules DRG d’un rat (collection bilatérale de L1 à L6, pour un total de 12 DRG) dans quatre puits d’une plaque de 24 puits ; il y a environ 5 x 104 cellules dans un puits d’une plaque de 24 puits.
note: Cette densité est adaptée à l’immunomarquage. Pour l’extraction par transfert Western ou par ARN, ensemencez les cellules DRG d’un rat (bilatérales L1-L6) dans un puits d’une plaque à 6 puits.
- Remplacer le milieu de culture le lendemain par l’ajout de 10 μM de cytarabine (Ara-C) et de 100 ng/mL de NGF et rafraîchir le milieu tous les deux jours par la suite.
note: Les DRG thoraciques peuvent également être cultivés par ce protocole, s’ils ont été collectés dans la colonne thoracique.
