$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
REMARQUE : Les solutions de culture cellulaire doivent être préparées à l’aide de procédures stériles dans une enceinte de sécurité biologique et filtrées à 0,2 μm pour éviter toute contamination.
1. Préparation des solutions et du milieu de culture
- Préparez la solution d’enrobage de laminine en diluant 20 μL de stock de laminine 1 mg/mL dans 2 mL de H2O. Distillé stérile. Préparer le jour de la dissection.
- Préparez une solution d'arrêt de sérum d'équidé (cheval) à 10 % en ajoutant 5 ml de sérum d'équidé (ES) à 45 ml de 1 solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Filtre stérile à l’aide d’un système de filtre de 0,2 μm ou d’un embout de filtre à seringue. Conserver à 4 °C.
- Préparez une solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 4 % en ajoutant 2 g de poudre de BSA à 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et en la portant à un volume final de 45 mL. Filtre stérile à l’aide d’un système de filtre de 0,2 μm ou d’un embout de filtre à seringue. Conserver à 4 °C.
- Préparez une solution mère de papaïne en diluant la papaïne à 3 mg/mL dans 1x HBSS. Filtre stérile à l’aide d’un système de filtre de 0,2 μm ou d’un embout de filtre à seringue. Conserver à -20 °C.
- Préparez une solution de désoxyribonucléase (DNase) en ajoutant 20 mg de poudre de DNase à duH2O stérile et en l’amenant à un volume final de 20 ml. Filtre stérile à l’aide d’un système de filtre de 0,2 μm ou d’un embout de filtre à seringue. Conserver à -20 °C.
- Préparez une solution mère d’acide ascorbique en ajoutant 352 mg d’acide ascorbique à du H2O distillé stérile et en l’amenant à un volume final de 20 ml. Si nécessaire, chauffer dans un bain à 37 °C pour dissoudre. Filtre stérile à l’aide d’un système de filtre de 0,2 μm ou d’un embout de filtre à seringue. Conserver à -20 °C.
- Préparez le milieu de culture cellulaire en ajoutant les éléments suivants à 50 ml de milieu neurobasal : 500 μL de Glutamax (100x), 500 μL de sérum équin, 1 mL de B-27, 100 μL d’acide ascorbique, 500 μL de pénicilline-streptomycine, 50 μL de kanamycine et 50 μL d’ampicilline. Filtre stérile à l’aide d’un système de filtration de 0,2 μm. Conserver à 4 °C.
- Préparez une solution de Triton X-100 à 0,01 % en ajoutant 1 mL de Triton X-100 dans 9 mL de 1x PBS pour obtenir une solution à 10 %. Comme le Triton X-100 est visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir complètement. Chauffer dans un bain à 37 °C pour dissoudre si nécessaire. Conserver à 4 °C.
- Pour diluer 10 % de la crosse Triton X-100 à 0,01 %, effectuez 3 dilutions en série 1:10. Diluer 1 mL de bouillon à 10 % dans 9 mL de 1x PBS pour faire une solution à 1 %. Diluer 1 mL de solution à 1 % dans 9 mL de 1x PBS pour obtenir une solution à 0,1 %. Diluer 1 mL de solution à 0,1 % dans 9 mL de 1x PBS pour obtenir une solution à 0,01 %.
- Préparez des solutions de sérum de chèvre normal (NGS) à 10 % et à 1 % en ajoutant 1 mL de NGS à 9 mL de 1 PBS pour une solution à 10 % et de 100 μL de NGS à 9,9 mL de 1 PBS pour obtenir une solution à 1 %.
- Préparez une solution mère de glutamate (100 mM) en ajoutant 735 mg d’acide L(+)-glutamique à du H2O distillé stérile et en l’amenant à un volume final de 50 mL. La solubilité à cette concentration sera un problème. L’ajout de petits volumes (100 μL) d’acide chlorhydrique 1 M est suffisant pour augmenter la solubilité.
- Préparez une solution mère de NBQX (10 mM) en ajoutant 50 mg de NBQX à du H2O distillé stérile et en l’amenant à un volume final de 13 mL.
2. Préparation des boîtes de culture et des lamelles (Faite la veille de la dissection)
REMARQUE : Nous avons constaté que la combinaison de trois agents d’enrobage, la poly-L-lysine, la poly-L-ornithine et la laminine, permet une adhérence et une viabilité cellulaires idéales.
- Placez 10 boîtes de Pétri de 35 mm dans une enceinte de sécurité biologique. Placez deux lamelles circulaires de 12 mm dans chaque plat et remplissez-les d’EtOH à 70 % pendant 10 min. Utilisez une conduite de vide pour aspirer l’EtOH restant de chaque plat, ce qui permet à l’EtOH de s’évaporer complètement.
- Pipeter ~90-100 μL d’une solution de poly-L-lysine à 0,1 % sur chaque lamelle, en s’assurant que toute la lamelle est recouverte. Couvrez les plats avec des couvercles et placez-les dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h.
- Aspirer la solution de poly-L-lysine restante de chaque lamelle et rincer avec duH2O stérile.
- Répétez les étapes 2.2 et 2.3 avec une solution de poly-L-ornithine à 0,1 %.
- Encore une fois, répétez les étapes 2.2 à 2.3 avec une solution de laminine à 0,01 %. Placer dans un incubateur à 37 °C/5 % de CO2 jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’enrobage cellulaire le lendemain.
3. Dissections embryonnaires de souris
REMARQUE : Nous utilisons entre 4 et 6 souris enceintes chronométrées par culture. Bien qu’une grande partie du processus de dissection se déroule à l’extérieur d’une enceinte de sécurité biologique, il est toujours important de maintenir une procédure stérile. L’idéal est d’utiliser abondamment 70 % d’EtOH sur les surfaces proches du microscope de dissection et sur les outils chirurgicaux. Un masque peut également être porté pendant la dissection pour prévenir davantage la contamination. De plus, nous utilisons 4 antibiotiques distincts dans le milieu de culture, de sorte qu’une contamination est peu probable. Cependant, si l’utilisation d’antibiotiques est problématique, cette configuration de dissection pourrait être déplacée à l’intérieur d’une cagoule stérile. Pour préserver la viabilité cellulaire, toutes les solutions de dissection doivent être pré-refroidies à 4 °C, et les dissections doivent être terminées le plus rapidement possible. Nous n’effectuons pas les dissections sur glace. La méthode de dissection des neurones embryonnaires du mésencéphale de souris est identique aux méthodes décrites précédemment.
- Préparez un espace sur une paillasse près d’un microscope de dissection avec un tampon absorbant et vaporisez généreusement avec 70 % d’EtOH.
- Vaporisez deux boîtes de Pétri en verre de 100 x 15 mm et une boîte de Pétri en verre de 50 x 10 mm avec 70 % d’EtOH et laissez l’EtOH s’évaporer. Une fois évaporé, placez 50 ml de HBSS stérile dans chaque boîte de Pétri de 100 x 15 mm.
- Immergez les ciseaux chirurgicaux, la pince et la lame du microtome dans 70 % d’EtOH pendant 10 min minimum pour stériliser. Placez les instruments sur le tampon absorbant pour les faire sécher.
- En utilisant du CO2 suivi d’une luxation cervicale, euthanasiez des souris de grossesse programmées de 2 à 3 mois au 14e jour embryonnaire.
- Vaporisez l’abdomen des souris euthanasiées avec 70 % d’EtOH. À l’aide d’une pince, saisissez le bas-ventre et ouvrez la cavité abdominale à l’aide de ciseaux chirurgicaux. Commencez à couper près de l’endroit où les pinces maintiennent l’abdomen, en faisant des coupes latérales de chaque côté jusqu’à ce que la paroi abdominale puisse être repliée et que l’utérus soit clairement visible.
- À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez les deux extrémités de la corne utérine. Ensuite, retirez l’utérus et placez-le dans une boîte de Pétri avec 1x HBSS.
- À l’aide d’une pince à bout droit, retirez soigneusement les embryons de l’utérus. Laissez les embryons dans HBSS tout au long de ce processus. À l’aide de la pince ou d’une lame de microtome, décapitez rapidement les embryons en coupant près du cou. Faire une coupe aussi plate que possible.
- À l’aide d’un microscope à dissection, placez la tête d’un embryon dans une boîte de Pétri sèche de 50 mm et placez-la sur la face ventrale. Stabilisez la tête à l’aide d’une pince en la plaçant et en la pénétrant près des yeux et du museau. La pince doit être inclinée vers le bas à ~45° pour éviter de pénétrer dans le mésencéphale.
- À l’aide de la pince, retirez soigneusement la couche translucide de peau et de crâne juste avant la crête proéminente du mésencéphale. Commencez près de la ligne médiane et retirez la peau et le crâne par voie caudale jusqu’à ce que le mésencéphale soit complètement exposé.
- Tenez la pince perpendiculairement au mésencéphale exposé, avec une pointe entre le cortex et le mésencéphale et l’autre près du cervelet. Appuyez et pincez les pinces ensemble pour retirer tout le mésencéphale. Le segment du mésencéphale doit avoir une épaisseur d’environ 0,5 mm. Placez le segment du mésencéphale dans la deuxième boîte de Pétri remplie de HBSS frais. Répétez ce processus pour chaque embryon.
- À l’aide du microscope de dissection, positionnez le segment cérébral avec la face ventrale vers le haut. Si les méninges sont toujours attachées, retirez-les soigneusement en les saisissant avec la pince et en les soulevant vers le haut et loin du segment cérébral.
- Le segment cérébral doit avoir 4 quadrants visibles. Placez le segment de manière à ce que les deux petits quadrants soient positionnés au-dessus des deux plus grands. Il y a une crête proéminente séparant les deux (petits) quadrants supérieurs des deux (grands) quadrants inférieurs.
- À l’aide de la pince, pincez et séparez les quadrants supérieurs des quadrants inférieurs, puis jetez les quadrants supérieurs. Les quadrants inférieurs restants auront un excès de tissu latéral sur le côté dorsal, ce tissu aura l’air moins opaque que le tissu ventral restant. Retirez le tissu dorsal moins dense et jetez-le. Le segment restant doit contenir à la fois la Substantia nigra pars compacta (SNc) et l’aire tegmentale ventrale (VTA).
- À l’aide de la pince, coupez le segment de tissu ventral restant en 4 petits morceaux et, à l’aide d’une pipette de 1 ml de large, transférez ces segments dans un tube conique de 15 ml avec 1x HBSS. Gardez le tube conique avec les segments cérébraux sur de la glace tout au long de la procédure.
- Répétez ce processus pour tous les segments de cerveau restants.
4. Dissociation des cellules
- Digestion enzymatique des cellules
- Aspirez soigneusement le HBSS du tube conique de 15 mL contenant les segments du mésencéphale, en laissant les segments au fond du tube.
- Ajouter ~800 μL de solution de papaïne dans le tube et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 7 min. Remettre les cellules en suspension en agitant le tube et les remplacer par l’incubateur à 37 °C pendant 7 minutes supplémentaires.
- À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL de grand calibre, prélever uniquement les segments du mésencéphale dans une aliquote de 1 mL de DNase. Laisser les segments atteindre le bas de l’aliquote ou environ 1 min d’exposition.
- À l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml de gros calibre, prélever uniquement les segments du mésencéphale dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de solution d’arrêt. Laissez les segments se déposer au fond du tube et répétez le rinçage dans un tube conique supplémentaire rempli de solution d’arrêt.
- Trituration mécanique de la suspension cellulaire
- Dans le deuxième butée, rincer la solution du tube à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL à large diamètre, pipeter les cellules de haut en bas 10 fois jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de gros segments de tissu visibles. Il est important d’éviter la sur-tituration pour une lyse cellulaire minimale.
- Pipeter lentement 300 μL de solution de BSA à 4 % jusqu’au fond du tube conique de 15 mL contenant les segments de cerveau. Retirez délicatement la pointe de la pipette pour maintenir une couche de suspension. Centrifuger à 0,4 x g pendant 3 min. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 400 μL de milieu de culture cellulaire.
5. Placage des cellules
REMARQUE : D’après l’expérience, environ 100 000 cellules viables par embryon sont collectées. Les souris enceintes de 2 à 3 mois ont généralement des portées de 8 à 10 embryons ; par conséquent, une estimation approximative du rendement total de cellules par souris enceinte chronométrée est d’environ 1 million de cellules.
- À l’aide d’un hémocytomètre, effectuer une numération cellulaire, puis diluer la suspension à 2 000 cellules/μL à l’aide d’un milieu de culture cellulaire. Triturer brièvement pour mélanger.
- Retirez les lamelles avec la solution de laminine de l’étape 2 de l’incubateur et aspirez la solution de laminine restante des lamelles enrobées à l’aide d’un aspirateur. Plaquez rapidement pour éviter que les lamelles ne sèchent complètement. Pipeter 100 μL (2,0 x 105 cellules/lamelle) sur chaque lamelle et placer des boîtes de Pétri dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h.
- Ajoutez délicatement 3 ml de milieu de culture cellulaire dans chaque plat et remettez-le dans l’incubateur à 37 °C. Effectuez des changements mi-moyens deux fois par semaine pendant 2 semaines.
6. Infection de la culture cellulaire à 14 DIV avec des vecteurs viraux adéno-associés (AAV)
- Pour chaque plat, préparer 1 mL de milieu DMEM sans sérum avec 1 μL de hSyn-GCaMP6f AAV (1,0 x 1013 titres)
- Aspirez le milieu de culture cellulaire de chaque boîte et remplacez-le par 1 mL de DMEM sans sérum contenant hSyn-GCaMP6f. Ensuite, remettez les plats dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h.
- Aspirez le milieu sans sérum contenant des AAV et remplacez-le par 3 mL de milieu de culture cellulaire. Remettez les plats dans l’incubateur à 37 °C. Nous avons constaté que 5 à 7 jours d’infection par l’AAV permettent d’obtenir des niveaux idéaux d’expression de GCaMP. Tout au long de cette période d’infection virale, continuez à changer de milieu tous les 2-3 jours.
7. Imagerie confocale Ca2+ en direct entre 19-21 DIV
- Préparation des tampons d’enregistrement
- Pour fabriquer 1 L de tampon d’enregistrement HEPES, ajoutez : 9,009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glucose, 2,381 g de HEPES, 2 mL de solution mère de 1 M de CaCl2 et 500 μL de solution mère de 1 M MgCl2 à 800 mL de H2O distillé stérile. Portez le pH à 7,4 avec du NaOH. Porter à un volume final de 1 L.
- Pour fabriquer 200 ml de tampon d’enregistrement de glutamate de 20 μM, diluez 40 μL de solution mère de glutamate de 100 mM dans 200 mL de tampon d’enregistrement HEPES décrit ci-dessus.
- Pour fabriquer 200 ml de tampon d’enregistrement NBQX 10 μM, diluez 200 μL de solution mère NBQX 10 mM dans 200 ml de tampon d’enregistrement HEPES.
- Imagerie confocale
- Remplissez une boîte de Pétri stérile de 35 mm avec 3 ml de tampon d’enregistrement.
- Retirez une boîte de Pétri de 35 mm contenant des cultures infectées de l’incubateur à 37 °C. À l’aide d’une pince à pointe fine, saisissez soigneusement le bord d’une lamelle et transférez-la rapidement dans la boîte de Pétri remplie de tampon d’enregistrement. Replacez la lamelle restante dans le milieu dans l’incubateur à 37 °C. Transportez la parabole avec la mémoire tampon d’enregistrement jusqu’au microscope confocal.
- Démarrez le logiciel d’imagerie. Passez à l’étape suivante pendant l’initialisation.
- Démarrez la pompe péristaltique et placez la ligne dans le tampon d’enregistrement. Calibrer la vitesse d’écoulement à 2 mL/min.
- Transférez la lamelle infectée de la boîte de Pétri de 35 mm dans le bain d’enregistrement.
- À l’aide de l’objectif à immersion dans l’eau 10x et de la lumière BF, trouvez le plan de mise au point et recherchez une région avec une forte densité de corps cellulaires neuronaux. Passez à l’objectif à immersion dans l’eau 40x et, à l’aide de la lumière BF, remettez l’échantillon au point.
- Dans la fenêtre « Liste des colorants » de FluoView, sélectionnez AlexaFluor 488 et appliquez-le.
- L’expression de l’AAV peut être variable ; par conséquent, afin d’éviter la surexposition et le photoblanchiment des fluorophores, commencez par des réglages de faible HV et de puissance laser. Pour le canal AlexaFluor 488, réglez la haute tension (HV) sur 500, le gain sur 1x et le décalage sur 0. Pour la ligne laser 488, réglez la puissance sur 5 %. Afin d’augmenter le volume effectif imagé dans le plan z, augmentez la taille du sténopé à 300 μm. Utilisez l’option de balayage « focus x2 » pour ajuster de manière optimale les signaux d’émission aux niveaux de sous-saturation. À partir de là, les paramètres peuvent être ajustés jusqu’à ce que la visibilité idéale de chaque canal soit atteinte.
note: Pour capturer avec précision la gamme complète des flux Ca2+ avec GCaMP, ajustez les paramètres de base HV et de puissance laser afin de permettre une augmentation de l’intensité fluorescente sans sursaturer le détecteur.
- Une fois les paramètres du microscope optimisés, déplacez la platine afin de localiser une région avec plusieurs cellules présentant des changements spontanés de fluorescence GCaMP6f et de faire la mise au point sur le plan souhaité pour l’imagerie.
- Utilisez l’outil « Clip rect » pour découper l’image d’imagerie à une taille qui peut atteindre un intervalle d’image d’un peu moins de 1 seconde. Ceci est nécessaire pour régler l’intervalle d’imagerie à 1 image par seconde.
- Réglez la fenêtre « Interval » sur une valeur de 1,0 et la fenêtre « Num » sur 600.
note: Afin de fournir différents tampons d’enregistrement au point temporel souhaité (300 s), il est important de calibrer la latence de la pompe pour délivrer la nouvelle solution dans le bain. Cela dépendra du débit de perfusion de la solution (2 mL/min) et de la longueur de la ligne utilisée pour pomper la solution.
- Pour capturer une vidéo de série T, sélectionnez l’option « Temps », puis utilisez l’option de balayage « XYt » pour commencer l’imagerie.
- Surveillez la barre de progression de l’imagerie et déplacez la ligne du tampon d’enregistrement HEPES dans le tampon d’enregistrement du glutamate de 20 μM au moment approprié (par exemple, si la latence de la pompe est calibrée pour délivrer la solution à 60 s, déplacez la ligne dans le tampon de glutamate à 240 images afin de délivrer du glutamate à 300 s).
- Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez le bouton Série terminée et enregistrez le film de la série T terminé. Continuez à perfuser 20 μM de glutamate pendant 5 minutes supplémentaires, de sorte que les neurones cultivés aient été exposés au glutamate pendant un total de 10 minutes. Répétez ce processus pour chaque lamelle à imager.
- Après l’exposition supplémentaire de 5 minutes à 20 μM de glutamate, retirez la lamelle du bain et remettez-la dans la boîte de Pétri de 35 mm contenant la mémoire tampon d’enregistrement jusqu’à la fin de la journée d’imagerie.