Préparation de tranches de cortex rhénan-hippocampe à partir du cerveau d’un petit rat

Résumé

Source : Valente, C. A., et al., Un modèle d’épileptogénèse dans les cultures de coupes organotypiques du cortex rhénanique-hippocampe. J. Vis. Exp. (2021)

La vidéo démontre une méthode permettant d'obtenir des tranches de cortex rhinal-hippocampe à partir du cerveau d'un petit rat et de les cultiver dans des inserts membraneux au sein d'une plaque multi-puits remplie de milieux pour une analyse plus approfondie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe

NOTE : La préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe utilise des rats Sprague-Dawley P6-7.

1. Mise en place de la culture et préparation du milieu
   1. La veille de la culture, préparez le milieu requis et placez-le à 4 °C.
   2. Préparez le milieu de dissection : 25 mM de glucose dans la solution saline équilibrée de Gey (GBSS).
   3. Préparez le milieu de culture : 50 % d’Opti-MEM, 25 % de HBSS, 25 % de sérum de cheval (HS), 25 mM de glucose, 30 μg/mL de gentamycine.
   4. Préparez le milieu d’entretien : Neurobasal-A (NBA), 2 % B27, 1 mM de L-glutamine, 30 μg/mL de gentamycine, HS (15 %, 10 %, 5 % et 0 %).
2. Prélèvement cérébral
   1. Juste avant de commencer la culture, ajoutez 1,1 mL de milieu de culture dans chaque puits de la plaque à 6 puits avec une pipette P1000 et placez-le à 37 °C.
   2. Placez tout l’équipement (microscope de dissection, hachoir à tissus, lampe de dissection, outils de dissection, électrodes, plaques, inserts et papiers-filtres) à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique et stérilisez à la lumière UV pendant 15 minutes.
   3. Ajustez l’épaisseur de la tranche à 350 μm.
   4. Retirez le GBSS du réfrigérateur. Ajouter 5 ml de GBSS dans six boîtes de Pétri. Six boîtes de Pétri seront nécessaires par animal.
   5. Euthanasier le petit rat. Effectuez la décapitation à l’aide d’un ciseau tranchant à la base du tronc cérébral de l’animal.
   6. Lavez la tête de l’animal trois fois dans du GBSS froid et apportez-la dans l’enceinte de sécurité.
3. Isolement tissulaire et préparation de coupes
   1. Insérez fermement des pinces pointues dans les orbites pour maintenir la tête.
   2. À l’aide d’un ciseau fin, coupez la peau/le cuir chevelu le long de la ligne médiane, en partant du foramen vertébral vers les lobes frontaux, et mettez-le de côté.
   3. Coupé de la même manière que le crâne et le long de la fissure transversale cérébrale (espace entre le cerveau et le cervelet). À l’aide d’une longue pince incurvée, écartez-le.
   4. Jetez les bulbes olfactifs à l’aide d’une spatule. Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un GBSS glacé, la face dorsale vers le haut (figure 1A).
   5. Insérez la pince fine dans le cervelet et longez la ligne médiane avec la spatule en ouvrant chaque hémisphère avec beaucoup de précaution (Figure 1B).
   6. À l’aide d’une pince à courbe courte, retirez soigneusement l’excès de tissu qui recouvre l’hippocampe, sans toucher la structure de l’hippocampe. Puis à l’aide d’une spatule, coupez sous chaque hippocampe (Figure 1C).
   7. Prenez un hémisphère et placez-le, avec l’hippocampe vers le haut, sur un papier filtre. Répétez la procédure avec l’autre hémisphère et placez-le parallèlement au premier, dans le papier filtre. Placez le papier filtre sur le hachoir à tissus, avec les hémisphères perpendiculaires à la lame, et coupez les hémisphères en tranches de 350 μm (Figure 1D).
   8. Placez le tissu tranché dans une boîte de Pétri avec du GBSS froid (Figure 1E).
   9. Séparez soigneusement les tranches à l’aide des électrodes à bout rond (Figure 1F). Ne conservez que les tranches avec un cortex rhinal et un hippocampe structurellement intacts. Les zones DG et CA doivent être parfaitement définies, ainsi que le cortex entorhinal et périrhinal (Figure 1G).
   10. Placez chaque tranche sur l’insert (Figure 1H-I), à l’aide d’une spatule et d’une électrode à bout rond. Retirez l’excès de milieu de dissection autour de chaque tranche à l’aide d’une pipette P20 (Figure 1J). Quatre tranches de cortex rhinal-hippocampe peuvent être cultivées dans un seul insert (Figure 1K).
4. Entretien de la culture
   1. Changez de support tous les deux jours.
   2. Réchauffez le milieu à 37 °C.
   3. Sortez les assiettes de l’incubateur. Saisissez chaque insert en tenant le bord en plastique à l’aide d’une pince (Figure 1L).
   4. Utilisez une main libre pour aspirer le fluide du puits. Remettez l’insert dans le puits et ajoutez 1 ml, à l’aide d’une pipette P1000, de milieu frais réchauffé (figure 1M). Répétez l’opération pour tous les inserts. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée entre la membrane et le fluide.

Résultats

Figure 1 : Procédure détaillée pour la préparation de coupes organotypiques du cortex rhinal-hippocampe. (A) Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un GBSS glacé avec la surface dorsale vers le haut. (B) Insérez la pince dans le cervelet. Ouvrez le cerveau par la ligne médiane et retirez l’excès de tissu sur l’hippocampe. (C) Avec une...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames pour manche de scalpel	Outils scientifiques fins	Référence 10011-00
Système de chambre de coupe de cerveau/tissu	Warner Instruments
Inserts de culture cellulaire, 30 mm, PTFE hydrophile	Millipore SAS	PICM03050
Incubateur conventionnel	Thermo Scientific Heraeus	BB15, ligne de fonction	Réglé à 37 °C et 5 % de CO2
D(+)-Glucose monohydraté	Merck Millipore	Référence 1.08342.1000
Solution de D-(+)-glucose, 45 % dans l’eau	sigma	Référence G8769
hydrogénophosphate disodique dihydraté	Merck Milipore	Référence 1.06580.1000
Dumont #5 Pince Fine Biologie Inox	Outils scientifiques fins	Référence 11254-20
Dumont #5 Pince Standard Inox	Outils scientifiques fins	Référence 11251-20
Dumont #7 Pince Standard Dumoxel	Outils scientifiques fins	Référence 11271-30
Dumont Medical Pince #7S Courbe Courte Inox	Outils scientifiques fins	Référence 11273-22
Solution mère de gentamycine, 50 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	Référence 15750-037
Solution saline équilibrée de Gey (GBSS)	Industries biologiques	Référence 01-919-1A
Électrodes en verre	Produits scientifiques	GB150F-10	Pointes rondes faites maison
Pipettes Pasteur en verre, 230 mm	VWR International	Référence 612-1702
Sérum de cheval, inactivé par la chaleur (HS)	Thermo Fisher Scientific	Référence 26050-088
Spatule Iris Courbée	Outils scientifiques fins	Référence 10092-12
Armoire de sécurité biologique de classe II de Labculture	HERASafe	SH 12
Solution de L-Glutamine 200 mM (Q)	Thermo Fisher Scientific	Référence 25030-024
Neurobasal-A Moyen (NBA)	Thermo Fisher Scientific	Référence 10888-022
Opti-MEM® I Sérum Réduit Moyen	Thermo Fisher Scientific	Référence 31985-047
Platine 5 lames	Gillette
Papier filtre qualitatif, cellulose, grade 1, 55 mm	Whatman	Référence 1001-055	Rétention moyenne 11μm
Papier filtre qualitatif, cellulose, grade 1, 90 mm	Whatman	Référence 1001-090	Rétention moyenne 11μm
Manche de scalpel	Outils scientifiques fins	Référence 91003-12
Plaques stériles à 6 puits traitées TC	Corning	CORN3516
Régulateur de température	SOCIÉTÉ DES SYSTÈMES MÉDICAUX	TC-102
Hachoir à tissus	Le Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.	MTC/2	Réglé à 350 μm