Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Isolement, culture et stimulation des cellules NK
- Générer un neurone nocicepteur intact (contrôle du compagnon de portée ; Souris TRPV1wt ::D TAfl/wt) et ablation (TRPV1cre ::D TAfl/wt) en croisant des souris lox-stop-lox-diphtérie toxine (DTAfl/fl) avec des souris TRPV1cre/wt.
- En utilisant l’inhalation de CO2, euthanasiez une souris témoin naïve (TRPV1wt ::D TAfl/wt).
- Prélever la rate dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 500 μL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
- Homogénéiser la rate à l’aide d’un pilon.
- Diluez les cellules avec 1 mL de PBS stérile.
- Filtrer le mélange à travers une crépine de 50 μm dans un tube conique de 15 mL.
- Complétez le volume (10 ml) avec du PBS stérile.
- Prélever 10 μL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifuger les cellules (500 × g, 5 min) et retirer le surnageant.
- Remettre les cellules en suspension à une concentration de 10à 8 cellules/mL dans un milieu RPMI 1640 supplémenté.
- Suivez les instructions du fabricant pour purifier magnétiquement les cellules Natural Killer (NK) de la rate à l'aide d'un kit d'isolement de cellules NK de souris. Confirmez la pureté des cellules NK à l’aide de la cytométrie en flux.
- Prélever 10 μL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Centrifuger les cellules (500 × g, 5 min) et retirer le surnageant.
- Remettre en suspension les cellules NK dans un milieu de culture RPMI 1640 supplémenté (contenant de l’IL-2 et de l’IL-15).
- Culture de 2 × 10 cellules 6 NK/mL dans une plaque à fond en U de 96 puits pendant 48 h.
2. Isolement et culture des neurones DRG
- 24 h avant la fin de la stimulation par cellules NK (étape 1.15), enduire une plaque de 96 puits avec 100 μL/puits de laminine (1 ng/mL) et incuber pendant 45 min (37 °C).
- Après l’incubation, retirez la solution et laissez les puits sécher à l’air libre dans une enceinte de biosécurité.
- En utilisant l’inhalation de CO2, euthanasier le neurone nocicepteur intact (contrôle du compagnon de portée ; TRPV1wt ::D TAfl/wt) ou souris ablatées (TRPV1cre ::D TAfl/wt).
REMARQUE : L’inhalation de CO2 est préférée à la luxation cervicale car elle évite de perturber les nerfs rachidiens reliés au DRG (ganglion de la racine dorsale).
- Fixez la souris sur le tableau en position couchée, soulevez la peau et incisez la peau le long de la colonne dorsale.
- Coupez l’articulation lombo-sacrée et séparez le sacrum de la colonne lombaire avec des ciseaux.
- Séparez la colonne vertébrale en coupant les muscles et les côtes des deux côtés de la colonne vertébrale dans la direction crânienne jusqu’à ce que la base du crâne soit atteinte.
- À l’aide de ciseaux, coupez la colonne vertébrale au niveau de l’articulation atlanto-occipitale.
- Retirez les muscles et les tissus adipeux de la colonne vertébrale.
- Épinglez et ouvrez la colonne vertébrale pour retirer la moelle épinière et accéder au DRG. Recherchez le DRG dans les foramens intervertébraux reliés à la moelle épinière par la racine dorsale mais séparés des méninges.
- Récoltez les DRG dans un tube conique de 15 ml rempli de 10 ml de DMEM supplémenté par glaci.
- Centrifuger la préparation (200 × g, 5 min, température ambiante) et retirer le surnageant.
- Ajouter 250 μL de PBS contenant de la collagénase IV (1 mg/mL) et de la dispase II (2,4 U/mL).
- Incuber le DRG avec la solution de Collagenase IV/Dispase II (C/D) (80 min, 37 °C, légère agitation). Lorsque vous accumulez des ganglions de plusieurs souris, maintenez un rapport de 125 μL de solution C/D par ganglion.
- Pour inactiver les enzymes, ajoutez 5 ml de milieu supplémenté en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium).
- Centrifuger la solution (200 × g, 5 min) et prélever délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Pour éviter une perte cellulaire indésirable, laissez ~100 μL de surnageant.
- Ajouter 1 mL de milieu DMEM supplémenté.
- À l’aide d’un pistolet à pipette et de trois pipettes Pasteur en verre de tailles décroissantes, triturez doucement (~10 haut/bas par taille de pipette Pasteur) le DRG en une préparation unicellulaire.
- Dans une enceinte de biosécurité, diluer l’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS stérile (solution saline tamponnée au phosphate) jusqu’à une concentration finale de 15 %. Conserver 1 mL d’aliquotes à −20 °C.
- Créez un gradient de BSA dans un tube conique de 15 mL en ajoutant 2 mL de PBS stérile et en distribuant lentement 1 mL de solution de BSA à 15 % au fond du tube. Évitez de perturber le dégradé en retirant délicatement la pipette.
- À l’aide d’une pipette P200, pipetez lentement la suspension des ganglions triturés (qui contient les neurones) sur le côté du tube dans le dégradé.
- Centrifuger le gradient de BSA contenant des neurones (200 × g, 12 min, température ambiante). Réglez l’accélération et la décélération de la centrifugeuse à la vitesse minimale.
REMARQUE : Après la centrifugation, les neurones seront au fond du tube, tandis que les débris cellulaires seront piégés dans le gradient BSA.
- Retirez délicatement tout le surnageant à l’aide d’une pipette.
- Remettre les cellules en suspension dans 500 μL de Neurobasal.
- Plaque 104 neurones par puits (200 μL de neurobasal/puits) dans une plaque à 96 puits recouverte de laminine et à fond plat.
REMARQUE : En moyenne, un enquêteur sera capable de remplir ~8 puits par souris.
- Cultivez les neurones (37 °C, pendant la nuit) pour permettre la fixation.
3. Co-culture
- Retirez lentement le neurobasal de la culture neuronale.
- Après 48 h de stimulation avec l’IL-2 et l’IL-15 (voir étapes 1.14-1.15), remettre les cellules NK en suspension et ajouter 105 cellules NK/puits à la culture neuronale (plaque à fond plat à 96 puits).
REMARQUE : En moyenne, l’enquêteur sera en mesure de remplir ~6 puits par souris.
- Co-culture des cellules dans un MX neurobasal supplémenté (37 °C, 48 h).
