Isolement et culture de neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire primaire de souris

Résumé

Source : Er, S., et al. Étude de l’accumulation de α-synucléine induite par des fibrilles préformées dans les neurones dopaminergiques du mésencéphale embryonnaire primaire de la souris. J. Vis. Exp. (2020).

La vidéo montre le processus d’isolement et de culture des neurones dopaminergiques du mésencéphale d’embryons de souris. Les planchers ventraux isolés du mésencéphale sont dissociés à l’aide d’enzymes. Les neurones dopaminergiques qui en résultent sont récoltés et transférés dans des micro-îlots à l’intérieur de plaques multi-puits. Les cellules sont incubées avec un milieu neuronal dopaminergique pour maintenir les cellules à une densité élevée à l’intérieur des micro-îles.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Préparation

1. Préparez un milieu neuronal dopaminergique (DPM) avec 0,46 % de D-glucose, 1 % de L-glutamine, 1 % de N2, 0,2 % de primocine, complété avec le mélange modifié de milieu et de nutriments Eagle F-12 de Dulbecco (DMEM/F12). Filtrez le DPM après avoir mélangé les ingrédients. Stocker les DPM à 4 °C et ne réchauffer chaque aliquote qu’une seule fois.
   note: Le DPM ne doit pas contenir de facteur de croissance dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF), car il réduira l’accumulation de α-synucléine dans les neurones dopaminergiques.
2. Préparez des pipettes en verre siliconé qui sont extrêmement hydrophobes, minimisant ainsi l’attachement à la surface et la perte de cellules lors de la manipulation initiale des neurones embryonnaires.
   1. Ajouter 10 ml de liquide de siliconation à 1 L d’eau distillée et mélanger en agitant dans un récipient de 2 L. Laissez les pipettes en verre immergées dans la solution de silicium pendant 15 min.
   2. Rincez les pipettes 3 à 5 fois à l’eau distillée. Faites sécher les pipettes pendant la nuit à température ambiante (RT) ou pendant 1 à 2 h dans un espace stérile chauffé à 100-120 °C pour accélérer le séchage.
   3. Stérilisez les pipettes par autoclave standard dans un sac d’autoclave scellé.
3. Préparez des plaques à 96 puits enrobées de poly-L-ornithine (PO) avec des fonds transparents en ajoutant 60 μL de solution PO dans les puits centraux de la plaque à 96 puits à utiliser pour l’ensemencement des neurones, en laissant au moins une rangée/colonne de puits sur les bords de la plaque pour éviter les effets de bord. Conservez la plaque revêtue toute la nuit à 4 °C ou 4 h à RT.
4. Avant de plaquer les cellules, aspirez complètement l’OP et lavez-les trois fois avec 100 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Aspirez 1x PBS des puits et laissez le couvercle de la plaque ouvert pour un séchage complet.
   note: Il est possible de collecter les bons de commande usagés et de les filtrer pour les réutiliser. Cette opération peut être répétée deux fois pour la même solution de bon de commande.
5. Ajouter 50 μL de DPM dans les puits préalablement enduits. Aspirez le DPM des puits avec une pointe en plastique de 100 μL et grattez simultanément le fond du puits avec des mouvements circulaires pour enlever le revêtement sur le périmètre de chaque puits. Un îlot recouvert de PO restera au milieu du puits.
6. Sous un capot laminaire, ajoutez 10 μL de DPM au milieu de chaque îlot enduit pour créer des micro-îlots.
   note: Une plaque avec des micro-îlots recouverts de DPM peut être maintenue sous la hotte à flux laminaire pendant 1 à 2 h pendant l’isolement des cellules

2. Isolement du plancher médio-sencéphale ventral à partir d’embryons de souris embryonnaires au jour 13.5 (E13.5)

1. Avant la dissection, remplissez une boîte de Pétri de 10 cm avec le tampon de Dulbecco et conservez-la sur de la glace.
2. Euthanasier une souris femelle enceinte E13.5 selon les directives de l'établissement. Placez la souris à plat sur le dos et vaporisez la partie antérieure du corps avec de l’éthanol à 70 %. Soulevez la peau au-dessus de l’utérus avec des pinces et faites une incision avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer l’utérus.
3. Retirez délicatement l’utérus et placez-le dans la boîte de Pétri préalablement préparée sur de la glace.
4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux sous le capuchon laminaire de la RT, retirez soigneusement les embryons de l’utérus. Retirez tous les résidus placentaires des embryons à l'aide d'une pince et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 cm remplie de tampon de Dulbecco.
5. À l’aide d’une pince à dissection ou d’aiguilles, coupez l’arrière-train de la tête aux endroits marqués de flèches noires sur la figure 1A. Retirez le morceau coupé du reste de l’embryon (figure 1B).
6. Placez l’arrière de la pièce coupée vers l’observateur (Figure 1C) et ouvrez-le doucement de la caudale au crânien (Figure 1D). À partir de 0,5 mm sous l’ouverture crânienne, coupez une région de^{2 mm 2} à 3 mm², illustrée à la figure 1E.
7. Prélever le plancher médio-sencéphale ventral (voir la figure 1F) dans un tube de microcentrifugation vide de 1,5 ml. Gardez le tube de microcentrifugation sur de la glace jusqu’à ce que tous les étages du mésencéphale y soient collectés.
   note: Alternativement, les planchers du mésencéphale peuvent être prélevés à l’aide d’une micropipette de 1 mL après dissection de tous les cerveaux embryonnaires.

3. Etablissement de cultures embryonnaires primaires du mésencéphale à partir d’embryons de souris E13.5 au format de plaque à 96 puits

1. Après le prélèvement des planchers du mésencéphale de tous les embryons dans le même tube de 1,5 ml, retirez le tampon de Dulbecco résiduel et lavez les morceaux de tissu trois fois avec 500 μL de solution saline équilibrée de Hank's (HBSS) sans Ca2⁺, sans Mg2⁺.
2. Retirer le HBSS et ajouter 500 μL de trypsine à 0,5 % dans le tube. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
3. Pendant l’incubation, réchauffer 1,5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à 37 °C, ajouter 30 μL de DNase I au FBS et mélanger. Polissez également au feu la pointe d’une pipette en verre siliconé. Assurez-vous que le trou n’a pas d’arêtes vives et qu’il est à peu près de la même taille qu’une pointe de micropipette de 1 ml.
   note: Comme alternative, une pointe de micropipette à faible adhérence de 1 ml peut être utilisée pour la trituration. Cependant, les pipettes en verre siliconé semblent donner les meilleurs résultats.
4. Dès la fin de l’incubation à l’étape 3.2, ajoutez 500 μL du mélange FBS/DNase au tissu partiellement digéré. Utilisez la pipette en verre pour triturer le tissu dans le mélange FBS/trypsine. Triturez jusqu’à ce que les tissus se dissocient en minuscules particules à peine visibles. Évitez les bulles lors de la trituration.
5. Laissez les particules restantes précipiter au fond du tube de microcentrifugation par gravité. Sans pipeter le précipité par le bas, recueillir le surnageant dans un tube conique vide en polypropylène de 15 ml.
6. Diluer la FBS/DNase I de l’étape 3.3 (98:2) avec 1 000 μL de HBSS pour obtenir la FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50). Mélanger par pipetage de haut en bas. Ajoutez 1 000 μL du nouveau mélange aux particules restantes dans le tube de la microcentrifugation. Triturez à nouveau et répétez l’étape 3.5.
7. Répétez l’étape précédente une fois de plus pour utiliser tous les FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50).
8. Une fois que tout le surnageant est recueilli à l’intérieur du tube de 15 mL (à partir des étapes 3.5, 3.7 et 3.8), utilisez une centrifugeuse de table pour faire tourner le surnageant (~3 mL) à 100 x g, pendant 5 min. Retirez le surnageant sans toucher les cellules granulées au fond.
9. Lavez la pastille cellulaire en ajoutant 2 mL de DPM dans le tube et faites-la tourner à 100 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant et répétez le lavage 2 fois pour minimiser les débris dans les cellules granulées.
   note: Utilisez toujours du DPM frais et réchauffé pour les neurones en culture. Pour les étapes de lavage, le DPM n’a pas besoin d’être frais, mais doit être préchauffé à 37 °C.
10. Diluez les cellules avec du DPM frais et chaud et transférez-les dans un tube de microcentrifugation. La quantité de DPM pour la dilution dépend du nombre d’embryons utilisés pour la dissection tissulaire. Par exemple, utilisez 150 μL de DPM pour diluer les cellules obtenues à partir de dix embryons.
11. Transférez 10 μL de cellules dans DPM dans un tube de microcentrifugation. Mélangez-les avec 10 μL de colorant bleu Trypan 0,4 %. Comptez les cellules vivantes (c’est-à-dire bleu trypan négatif) à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé.
    note: Utilisez 30 000 cellules pour le placage par puits pour obtenir ~1 000 neurones dopaminergiques par puits. Si la densité cellulaire est supérieure à ~30 000 cellules par 6 μL, diluez davantage les cellules avec DPM avant le placage afin que le volume d’ensemencement ne soit pas inférieur à 6 μL.
12. Sans toucher le fond des puits, retirez les DPM des micro-îlots créés à l’étape 1.6.
13. Afin d’obtenir une densité cellulaire reproductible au niveau de chaque puits, mélangez les cellules par pipetage doux avant de les plaquer dans le puits. À l’aide d’une micropipette de 1 à 10 μL, ajoutez 6 μL de cellules au milieu du puits, à l’emplacement de chaque ancien micro-îlot.
14. Remplissez les puits vides sur les bords de la plaque avec 150 μL d’eau ou 1x PBS pour minimiser l’évaporation des puits contenant des cultures neuronales. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 1 h.
15. Après 1 h, retirez la plaque de l’incubateur, ajoutez 100 μL de DPM dans chaque puits contenant des cellules et remettez-la dans l’incubateur.
16. Deux jours après le placage (jour in vitro 2, ou DIV2), prélever 25 μL et ajouter 75 μL de DPM frais pour porter le volume final du média à 150 μL et éviter autant que possible l’évaporation.
17. Remplacez la moitié du milieu par du DPM frais (c.-à-d. retirer 75 μL et ajouter 75 μL de DPM frais) à DIV5. N’effectuez aucune modification de support après DIV5.

Résultats

Figure 1 : Dissection du plancher du mésencéphale à partir d’un embryon de souris E13.5. (A) Les emplacements de coupe à l’arrière de la tête sont marqués de flèches noires et de lignes pointillées blanches. (B) Le morceau a été retiré du reste de l’embryon. La pièce retirée est encerclée. (C) La pièce a été tournée à 90° pour faire face à l’a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,4 % Trypan Bleu colorant	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	15250061
Tube en polypropylène CELLSTAR de 15 ml	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Allemagne	188261
4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	10236276001
5 M HCl	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
5 M NaOH	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
ViewPlate à 96 puits (noir)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, États-Unis	6005182
Éthanol à 99,5 % (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finlande	n/a
Fluide de siliconation AquaSil	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	Réf. TS-42799
Tube de microcentrifugation autoclavé de 1,5 ml	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
Dispositif de sonication Bioruptor	Diagenode, Liège, Belgique	B01020001
Solution saline équilibrée de Hank's (HBSS) sans Ca2+, Mg2+	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	Référence 14175-053
Progiciels CellProfiler et CellAnalyst	n/a	n/a	Logiciel open source gratuit
Centrifugeuse 5702	Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne	5702000019
Incubateur de CO2	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	n/a
Chambre de comptage	BioRad Inc., Hercules, Californie, États-Unis	1450015
Microscope ultra haute résolution DeltaVision avec table à air et armoire	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, États-Unis	29254706
Désoxyribonucléase-I (Dnase I)	Roche, Bâle, Suisse	22098700
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	21331–020
Le tampon de Dulbecco	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, États-Unis	10500056
D-glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	Référence G8769
Tampon salin phospohate (PBS)	n/a	n/a	Cuisine multimédia, Institut de biotechnologie, Université d’Helsinki
Primocin	InvivoGen, San Diego, Californie, États-Unis	Fourmi-PM-1, Fourmi-PM-2
poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	Réf. P4957
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, États-Unis	11332481001
trypsine	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, Chine	Référence 2199700