Dissection et montage d’explants de cerveau de larves de mouches des fruits

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Dissection et montage des explants de cerveau larvaire

1. Disséquer les cerveaux larvaires dans la solution saline externe physiologique (120 mM de NaCl, 4 mM de MgCl₂, 3 mM de KCl, 10 mM de NaHCO₃, 10 mM de glucose, 10 mM de saccharose, 5 mM d’acide N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl]-2-aminoéthanesulfonique (TES), 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 2 mM de Ca²⁺, pH de 7,2) sous un microscope de dissection (puissance de grossissement de 4,5x) avec deux paires de pinces de dissection à pointe standard #5 (11 cm). Utilisez une paire de pinces pour maintenir le corps larvaire en place et l’autre pour disséquer soigneusement le cerveau. Préservez les disques oculaires, les lobes cérébraux et le cordon nerveux ventral. Retirez les muscles attachés pour minimiser les mouvements de l’échantillon pendant l’imagerie.
2. Préparez une lame de verre (25 x 75 x 1,0 mm³) et utilisez une seringue pour dessiner une chambre carrée avec de la graisse sous vide.
3. Ajouter 20 μL de solution saline externe dans la chambre carrée avec des barrières à graisse.
4. Transférez les cerveaux larvaires disséqués dans la chambre sur la lame de verre à l’aide d’une pince. Ajustez la position du cerveau sous la portée de dissection pour vous assurer que la face dorsale est tournée vers le haut.
5. Couvrez la chambre avec une lamelle en verre (22 x 22 x 0,15 mm³). Le cerveau larvaire est maintenant monté sur la lame à l’intérieur d’une chambre remplie de solution saline externe (Figure 1B).
   note: Une légère pression sur la lamelle permet de confiner le cerveau et de réduire la dérive de l’échantillon lors de la séance d’imagerie qui suit.

Figure 1 : Flux de travail du protocole d’imagerie et de quantification de la dynamique des dendrites. (A) Le protocole contient six étapes couvrant la préparation des échantillons, la collecte d’images, le traitement d’images et la quantification semi-automatisée de la dynamique des dendrites. (B) Un schéma illustrant une chambre d’imagerie contenant un explant de cerveau larvaire monté avec la face dorsale vers le haut. L’explant cérébral a un neurone latéral ventral (LNv) étiqueté individuellement dans chaque lobe et est immergé dans la solution saline externe. Les barrières à graisse sous vide supportent le poids de la lamelle et forment une petite chambre qui empêche le cerveau de bouger.