Différenciation de cellules souches pluripotentes induites en cellules progénitrices neurales

Résumé

Source : Phillips, A. W., et al. Développement de corps embryoïdes libres sériques dérivés de HiPSC pour l’interrogation de cultures de cellules souches 3D à l’aide de tests physiologiquement pertinents. J. Vis. Exp. (2017).

La vidéo présente une technique de différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) en cellules progénitrices neurales (NPC). Initialement, les hiPSC sont cultivées sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF). Par la suite, les cellules sont détachées et transférées sur une plaque recouverte de biopolymère pour permettre aux MEF d’adhérer et de se séparer des hiPSC. Les hiPSC en suspension sont ensuite transférés sur une plaque à fond en V et centrifugés pour former des agrégats. Enfin, l’ajout d’un milieu de différenciation induit la différenciation des hiPSC au sein de l’agrégat en NPC.

Protocole

1. Génération de cellules progénitrices neurales

1. Maintenir les hiPSC dérivées de fibroblastes et de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dans des plaques à 6 puits sur une couche de cellules embryonnaires de souris (MEF) irradiée à γ dans un milieu iPSC humain complétée par de petites molécules.
   REMARQUE : L’entretien quotidien est une version modifiée des procédures précédemment signalées.
   1. Déposer 6 x 10⁵ MEF sur chaque puits d'une plaque de culture tissulaire à 6 puits dans un milieu recommandé de 300 μL/puits (selon le protocole du fabricant).
   2. Après 48 h, remplacer le milieu MEF par un milieu hiPSC de 300 μL/puits pendant 1 h avant d’ajouter le milieu hiPSC.
   3. Décongeler rapidement les hiPSC dans un bain-marie à 37 °C et ajouter lentement 1 mL de hiPSC à goutte. Transférez les hiPSC et le milieu dans un tube conique de 15 ml. Ajouter un milieu pour porter le volume total à 5 ml. Centrifuger pendant 4 min à 129 x g, aspirer le surnageant, remettre doucement la pastille en suspension dans un milieu hiPSC de 1 mL avec un inhibiteur de la protéine kinase associée à Rho (ROCK) à une concentration de 1:1 000.
   4. Plaquez la suspension cellulaire (généralement ensemencée à 300 000 cellules/puits) sur la couche cellulaire MEF et incubez à 37 °C, 5 % de CO₂, 95 % d’humidité.
   5. Surveillez de près la culture d’iPSC à l’aide d’un microscope optique. Après 48 h, retirez les cultures qui ont des bords inégaux, qui sont devenues kystiques ou qui apparaissent brun jaunâtre au microscope optique afin de minimiser la différenciation spontanée.
      note: Après 7 à 10 jours, des colonies de hiPSC devraient se former. Les colonies doivent être rondes, avec des bordures clairement définies et des densités cellulaires uniformes, et dépourvues de cellules non uniformes peu tassées.
   6. Sélectionnez manuellement les colonies rondes de hiPSC pour éliminer la culture des cellules spontanément différenciées. Élargissez les colonies en les plaçant sur des couches MEF fraîches. Étendez 1:3 tous les 7 jours lorsque les cultures se rapprochent de la confluence et gèlent.
2. Après l’expansion et la congélation des cellules (pour la sauvegarde), faites croître les colonies de hiPSC sur des plaques jusqu’à ce qu’elles atteignent 50 à 75 % de confluence.
3. Sept jours après le placage, utiliser un traitement enzymatique doux (5 à 10 min avec 300 μL de solution enzymatique) et une trituration douce (2 à 4 fois avec une pipette de 1 000 μL) pour récolter et préparer les hiPSC pour la différenciation des cellules précurseurs neurales.
4. Centrifuger la suspension cellulaire à 129 x g pendant 4 min, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu iPSC humain de 5 ml. Transférez la suspension cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 5 cm recouverte de gélatine à 0,1 % pendant 1 h à 37 °C pour éliminer les MEF et maximiser le rendement en hiPSC. Transférez le milieu (avec les cellules non adhérentes) dans un autre plat de 5 cm recouvert de gélatine.
5. Transférez les cellules non adhérentes dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’une pipette de transfert. Rincez délicatement les plaques avec un produit de 3 ml et ajoutez-le dans le tube de 15 ml.
6. Centrifugez la suspension cellulaire à 129 x g pendant 4 min, aspirez le surnageant et remettez doucement la pastille en suspension dans le milieu. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Plaque 9 000 cellules/puits dans une plaque inférieure en V à faible adhérence de 96 puits.
7. Centrifuger la plaque à 163 x g pendant 3 min. Incuber la plaque à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO₂. À l’aide d’une pipette, changer le milieu à 50 % tous les deux jours en prélevant la moitié du milieu et en le remplaçant par un milieu différenciateur frais chimiquement défini 1 (DM1 ; Graphique 1 ; Table des matériaux) pendant 14 jours.

Résultats

Figure 1 : Schéma décrivant les premières étapes de la préparation des SFEB. Une fois que les iPSC ont été récoltées à l’aide d’une dissociation enzymatique, elles sont plaquées dans des plaques à 96 puits et centrifugées à 163 x g pendant 3 minutes pour induire une agrégation rapide. Après 14 jours in vitro (DIV), les agrégats cellulaires peuvent être transférés à partir de plaques de 96 puit...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SFEB Neuronal Differentiation Milieux de culture cellulaire. Réactifs. Composants
Milieu d’induction neuronale STEMdiff (hiPSC Media)	Technologies STEMCELL	Tél. 0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Composants multimédias DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquide, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Remplacement du sérum knockout	Invitrogen	10828028	20 % 100ml
Stylo/Streptocoque	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Solution d’acides aminés non essentiels MEM 10 mM (100X), liquide	Invitrogen	11140050	5ml
2-Mercaptoéthanol (1 000X), liquide	Invitrogen	21985023	900ul
Petites molécules
Y27632 (ROCKi)	Tige	Référence 04-0012-10	10 uM
Composants/Matériaux
Fibroblastes embryonnaires de souris	GlobalStem	GSC-6301G
Fond en V de 96 puits avec couvercles	à feuilles persistantes	Référence 222-8031-01V
StemPro Accutase réactif de dissociation cellulaire	ThermoFisher	A1110501
6 puits fond plat	Faucon	353046