Développement et maintien de corps embryoïdes sans sérum

Résumé

Source : Phillips, A. W., et al. Développement de corps embryoïdes libres sériques dérivés de HiPSC pour l’interrogation de cultures de cellules souches 3D à l’aide de tests physiologiquement pertinents. J. Vis. Exp. (2017).

La vidéo décrit la procédure de développement de corps embryoïdes sans sérum (SFEB) à partir de cellules progénitrices neuronales à l'aide de divers milieux de différenciation sans sérum ou DM. DM-2 facilite la maturation et l'arrangement des neurones pour former des SFEB, tandis que DM-3 est utilisé pour le maintien de la croissance.

Protocole

1. Induction du corps embryoïde sans sérum (SFEB) (Figure 1)

1. Placer des inserts de culture cellulaire de 40 μm dans des plaques à 6 puits et ajouter 1 mL de milieu de différenciation 1 (DM1) (Table des matériaux) au moins 1 h avant d’ajouter les agrégats.
2. Transférez les agrégats de cellules progénitrices neurales avec un milieu de 20 μL à l’aide d’une pointe à large ouverture de 200 μL sur des inserts de culture cellulaire de 40 μm et remplacez le milieu par DM2 (Table of Materials).
   note: Les inserts de culture cellulaire sont des inserts spécialisés qui se trouvent légèrement à l’écart du fond du puits et se composent d’une membrane en polytétrafluoroéthylène suspendue sur un cadre en plastique. Cette membrane est biocompatible et peut soutenir efficacement le transport des nutriments et de l’oxygène vers les SFEB placés sur le dessus. Ils sont couramment utilisés avec des cultures organotypiques de tranches d’hippocampe prélevées sur une souris ou un rat.
   1. Transférez 4 à 6 agrégats dans un insert de culture cellulaire et laissez suffisamment d’espace entre les agrégats. Retirez autant de solution que possible à l’aide d’une pointe de pipette fine (par exemple, une pointe de 200 μL).
      REMARQUE : Il est acceptable de déranger brièvement les SFEB car ils se déplaceront sur l’insert de culture cellulaire lorsque la solution sera retirée des environs des SFEB.
   2. Maintenir les cultures dans 1 mL de DM2 à 37 °C, 95 % d’humidité et 5 % de CO2. À l’aide d’une pipette, changer 75 % du milieu tous les deux jours en prélevant les trois quarts du milieu et en le remplaçant par trois quarts de milieu frais. Par exemple, prélever 750 μL de milieu et ajouter 750 μL de milieu frais.
3. Après 14 jours de culture, passez au milieu DM3 (Table des Matériaux) avec un changement de milieu de 75 % tous les deux jours et pendant 16 jours supplémentaires.
4. Pour maintenir les SFEB sur les inserts de culture cellulaire au-delà de 30 jours, changez le milieu tous les deux jours pendant 60, 90 et 120 jours.
   note: Les SFEB atteignent environ 1 000 μm de diamètre et ont généralement une épaisseur de 100 à 150 μm.
5. Détachez les SFEB de l’insert en pipetant doucement le fluide à l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture de 200 μL. Pour transférer les SFEB, utilisez une pointe de pipette à large ouverture pour aspirer doucement les corps dans la pointe de la pipette. Après avoir chargé le SFEB dans l’embout de la pipette, transférez-le doucement dans des plaques à 12 puits et lavez-le avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 300 μL par puits.

Résultats

Figure 1 : Chronologie des changements et des phases de Medium au cours de la croissance et de l’expansion du SFEB.

Après avoir été transférés sur des inserts, les SFEB subissent deux changements moyens à 14 et 28 jours in vitro (DIV). Ils sont généralement récoltés pour des expériences aux DIV 30, 60 et 90. Les inserts supérieurs montrent diffé...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SFEB Neuronal Differentiation Milieux de culture cellulaire. Réactifs. Composants
Milieu d’induction neuronale STEMdiff (hiPSC Media)	Technologies STEMCELL	Tél. 0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)	GlobalStem	GSM-2001
Composants multimédias DM1
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquide, 1:1	Invitrogen	10565018	385 ml
Remplacement du sérum knockout	Invitrogen	10828028	20 % 100ml
Stylo/Streptocoque	Invitrogen	15140122	5ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Solution d’acides aminés non essentiels MEM 10 mM (100X), liquide	Invitrogen	11140050	5ml
2-Mercaptoéthanol (1 000X), liquide	Invitrogen	21985023	900ul
Composants multimédias DM2
D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquide, 1:1	Invitrogen	10565018	500ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Stylo/Streptocoque	Invitrogen	15140122	5ml
N-2 Supplément (100X), liquide	Invitrogen	17502048	10ml
Composants multimédias DM3
NEUROBASAL Milieu (1X), liquide	Invitrogen	21103049	500ml
Supplément de B-27 moins vitamine A (50X), liquide	Invitrogen	12587010	10ml
Glutamax 200mM	Invitrogen	35050061	5ml
Stylo/Streptocoque	Invitrogen	15140122	5ml
Composants/Matériaux
	Millicell	PICM0RG50
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	ThermoFisher	10010023	500 ml