Construction de circuits neuronaux structurés sur un réseau de multi-électrodes

Résumé

Source : Kanner, S., et al. Conception, traitement de surface, placage cellulaire et culture de réseaux neuronaux modulaires composés de circuits fonctionnellement interconnectés. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre le processus de culture de cellules neuronales sur un réseau multi-électrodes (MEA) à motifs pour établir des réseaux neuronaux modulaires. Cette méthode permet l’étude de la transmission des signaux neuronaux et des interactions cellulaires.

Protocole

1. Préparation du réseau multi-électrodes (MEA)

1. Nettoyez MEA dans cet ordre (Table des matériaux) :
   1. Laver à l’eau du robinet et sonicer 3 fois dans un détergent enzymatique concentré.
   2. Sonicate dans l’eau distillée 3 fois.
   3. Laver à l’eau distillée (dans la hotte, embout de 1 000 μl) pendant 3 fois et placer sous ultraviolets (UV) pendant 30 min.
2. Soutenir la préparation du réseau :
   1. Préparez le moule du réseau de support conçu.
      1. Verser le polydiméthylsiloxane (PDMS) dans une plaque à 12 puits (22 mm de diamètre).
      2. Lorsque le PDMS est durci, retirez le moule et, à l’aide d’un scalpel, découpez un trou au milieu pour créer une forme d’anneau.
      3. Placez un moule de réseau de support conçu au centre de la MEA (Figure 1A) et recouvrez le reste de la surface de poly-D-lysine (PDL) pendant 2 heures à température ambiante (RT).
   2. Retirer le PDL à l’aide d’une pipette et laver à l’eau distillée.
   3. Retirez le moule et laissez-le sécher (Figure 1A).
3. Alignez le pochoir sur MEA de la manière suivante :
   1. Placez le pochoir sur le micromanipulateur désigné. À l’aide d’un microscope inversé, alignez avec précision la structure à motifs sur les électrodes et abaissez le pochoir jusqu’à ce qu’il soit placé sur la surface MEA (Figure 1B).
      note: Le contact avec un MEA bien nettoyé assure une adhésion compétitive entre le PDMS et le MEA lui-même.
   2. Soulevez le micromanipulateur et, si nécessaire, utilisez une pince à épiler pour appliquer une petite quantité de pression au-dessus du PDMS afin d’éviter qu’il ne se détache du MEA.
   3. Appuyez doucement le pochoir sur la surface MEA et utilisez un microscope pour vérifier qu’il est fermement fixé et bien aligné (Figure 1C-D).
4. Placez le MEA dans une chambre à vide pendant 15 minutes et placez une goutte de 1 ml de PDL sur le pochoir.
5. Insérez-le dans la chambre à vide 2 fois pendant 20 minutes chacun. Laissez le PDL sécher O/N dans l’incubateur.
6. Avant le placage, retirez les pochoirs PDMS des MEA et lavez-les à l’eau stérile. Placer sous éclairage UV pendant 7 min.

2. Placage

1. Calculer le nombre de cellules nécessaires au placage à l’aide d’un hémocytomètre
   1. Assurez-vous que la chambre de comptage (hémocytomètre) est propre et placez-y une lamelle (utilisez de l’alcool pour nettoyer).
   2. Diluer 10 μl de suspension cellulaire dans 190 μl de produit de placage (dilution 1:20).
   3. Chargez 10 μl de cellules diluées sur le bord de la chambre de comptage et pipetez lentement les cellules, permettant à la chambre de se remplir d’elle-même.
   4. À l’aide d’un microscope inversé, visualisez la grille de l’hémocytomètre. Déterminez le nombre de cellules dans la chambre en comptant directement (les cellules saines doivent être rondes). Comptez les cellules à l’intérieur du grand carré sans que celles ne croisent les bords.
   5. Calculer la concentration des cellules :
      Nombre total de cellules/1000 μl = Nombre total de cellules comptées × facteur de dilution ×^{10 4} (surface de l’hémocytomètre).
      note: Par exemple, si le facteur de dilution était de 20 et que le nombre total de cellules comptées était de 100 :
      100 × 20 × 10⁴ = 0,1 x 10⁷ cellules/1 000 μl ou 1 x 10⁶/100 μl. Pour plaquer 0,75 x 10⁶ cellules, prélevez 75 μl des cellules.
2. Prenez le nombre de cellules nécessaires pour le placage par boîte de Pétri ou de MEA, remettez les cellules en suspension pour éviter l’agrégation et plaquez-les au centre, au-dessus de la zone à motifs (les cellules peuvent être diluées dans le milieu si nécessaire). Pour le MEA, placez une goutte de 100 μl au milieu. Pour la lamelle, placez une goutte de 1 000 μl au milieu.
3. Incuber les cellules plaquées à 37 °C pendant 40 min. Ajouter du milieu de placage dans les cellules plaquées, jusqu’à 1 ml par MEA et 2 ml par lamelle.
4. Conserver à 37 °C et diluer avec un milieu de croissance frais enrichi de 0,5 Pen-Strep, 2 % de B-27 et 0,75 % de glutamax tous les 4 jours.
5. À partir de 6/7 DIV, après avoir constaté des connexions entre les îles, diluez le milieu avec 10 μl/ml de FUDR (25 mg de désoxyuridine + 62,5 mg d’uridine dans 12,5 ml de MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) ou tout autre agent anti-mitotique pour prévenir la prolifération gliale.

Résultats

Graphique 1. PDMS structure le dépôt sur un MEA. (A) Moule PDMS en forme d’anneau (marqué par la flèche rouge) monté sur un MEA. Le moule est utilisé pour enrober la zone destinée au réseau neuronal de soutien et située à la périphérie de la zone de culture (celle-ci est limitée par l’anneau monté sur le MEA et marqué par la flèche verte). (B) Alignement d’un pochoir PDMS s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PDMS, Sylgard 184	Dow Corning
Chambre à vide Nalgene	thermo	Référence 5305-0609
Poly-D-Lysine PDL	sigma	P7886
Plaque de culture à 12 puits	sigma	CLS3336
5-Fluoro-2'-désoxyuridine	sigma	F0503
MEA1060-INV-BC	Systèmes multicanaux
TC02	Systèmes multicanaux
Streptocoque de stylo	Industries biologiques Beit Haemek	Référence 03-033-1C
B-27	Gibco	17504044
glutaMAX	Gibco	Référence 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle	Industries biologiques Beit Haemek	Référence 01-025-1B
Réseaux de micro-électrodes 4Q	Systèmes multicanaux	60-4QMEA1000iR-Ti-pr	Manuel de nettoyage : http://www.multichannelsystems.com