Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en motoneurones fonctionnels

Résumé

Source : Garone, M. G., et al. Conversion de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) en motoneurones spinaux et crâniens fonctionnels à l’aide de vecteurs PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente le processus de différenciation des iPSC humaines en motoneurones. La raison d’être consiste à utiliser des CSPi qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer des facteurs de transcription spécifiques. Lorsqu’il est cultivé dans un milieu contenant de la doxycycline, cet antibiotique déclenche l’expression des facteurs de transcription, favorisant ainsi la différenciation des iPSC en progéniteurs de motoneurones. En fin de compte, les progéniteurs sont cultivés dans un milieu neuronal pour produire des motoneurones matures et fonctionnels.

Protocole

1. Maintien des iPSC humaines

1. Préparation de plaques revêtues de matrice
   1. Décongeler un flacon de 5 mL de matrice (voir le tableau des matières) à 4 °C pendant la nuit. Les crosses matricielles d’origine sont disponibles à différentes concentrations de stock, et les aliquotes sont faites en fonction du facteur de dilution indiqué sur la fiche technique et sont spécifiques à chaque lot. Il est crucial de garder le flacon et les tubes à l’eau glacée pour éviter la gélification prématurée de la matrice. Distribuer la matrice en aliquotes dans des cryotubes pré-refroidis sur de la glace. Congelez les aliquotes non utilisées à -20 °C.
   2. Déposer une aliquote sur de la glace pendant environ 2 h pour la décongeler.
   3. Diluer l’aliquote de la matrice avec 20 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL.
   4. Bien mélanger et verser 1 mL de matrice diluée dans des plats de 35 mm (quantités équivalentes par surface d’autres plats).
   5. Conservez les plats contenant la matrice diluée pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’enrobage.
      note: La vaisselle, scellée avec un parafilm, peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
2. Préparation de la solution mère (20 mL) et 1x aliquotes de travail du réactif de dissociation cellulaire douce (voir tableau des matériaux).
   1. Dissoudre la poudre à 10 mg/mL dans du PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libre)
   2. Filtrer la stérilisation à travers une membrane filtrante de 0,22 μm.
   3. Préparez 20 aliquotes (1 mL chacune) et conservez-les à -20 °C.
   4. Avant utilisation, diluer une aliquote dans du PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libre) à 1 mg/mL (1x aliquotes de travail).
      REMARQUE : 1x aliquotes de travail peut être stocké à 4 °C pendant 2 semaines.
3. Passage d’iPSC humains.
   1. Avant de commencer : En cas de stockage à 4 °C, préchauffez les plaques recouvertes d’une matrice dans l’incubateur à 37 °C pendant 20 à 30 min. Préchauffez à température ambiante la quantité de milieu iPSC humain (voir le tableau des matériaux) nécessaire. Préchauffez le DMEM/F12.
   2. Milieu de culture par aspiration.
   3. Rincer les iPSC avec du PBS (sans Ca²⁺/Mg²⁺).
   4. Ajouter 1 solution de dissociation douce (0,5 mL pour une parabole de 35 mm). Incuber à 37 °C jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à se détacher de la plaque, généralement 3 à 5 min.
   5. Aspirez la solution de dissociation douce, en faisant attention de ne pas détacher les colonies d’iPSC.
   6. Lavez les cellules avec du DMEM/F12 (2 mL pour une parabole de 35 mm) et aspirez en faisant attention de ne pas détacher les cellules. Répétez cette étape une fois de plus.
   7. Ajouter du milieu iPSC humain (1 mL pour une parabole de 35 mm).
   8. Détachez doucement les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules et transférez-les dans un tube de 15 ml.
   9. Cassez doucement les amas de cellules en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 3 à 4 fois.
   10. Aspirer le surnageant de la ou des plaques revêtues d’une matrice.
   11. Ensemencez les cellules dans le volume de culture approprié du milieu iPSC humain. Le rapport de division peut varier d’une ligne à l’autre et est d’environ 1:4-1:8. Changez de support tous les jours.

2. Génération de lignées iPSC inductibles NIL et NIP

1. Transfection cellulaire
   1. Rincez les cellules avec du PBS (sans Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) (0,35 mL pour une boîte de 35 mm) et incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient séparées (5 à 10 min).
   3. Complétez en douceur la séparation des cellules en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 3 à 4 fois.
   4. Prélever dans un tube de 15 mL et ajouter du PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ libre) à 10 mL. Comptez les cellules.
   5. Granulez 10⁶ cellules et mettez-les en suspension dans 100 μl de tampon R (inclus dans le kit d’électroporation de cellules ; voir tableau des matériaux).
   6. Ajouter de l’ADN plasmidique pour la transfection : 4,5 μg de vecteur transposable (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP12) et 0,5 μg du plasmide transposase piggyBac.
   7. Transfecteur avec le système d'électroporation de la cellule (voir tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant et comme décrit précédemment avec les paramètres suivants : tension de 1 200 V, largeur de 30 ms, 1 impulsion. Ensemencez les cellules dans un milieu iPSC humain complété par 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK, voir le tableau des matériaux) dans une boîte enrobée d’une matrice de 6 mm.
2. Sélection avec des antibiotiques
   1. Deux jours après la transfection, ajouter 5 μg/mL de blasticidine dans le milieu de culture.
   2. La plupart des cellules non transfectées mourront dans les 48 heures suivant la sélection de la blasticidine. Conservez les cellules dans la blasticidine pendant au moins 7 à 10 jours pour contre-sélectionner les cellules qui n’ont pas intégré les transgènes dans le génome.
   3. Maintenir des cellules transfectées de manière stable en tant que population mixte, composée de cellules avec différents nombres de transgènes et différents sites d’intégration, ou isoler des clones uniques.
   4. Préparez une boîte supplémentaire pour vérifier l’expression efficace des transgènes lors de l’induction de 1 μg/mL de doxycycline par RT-PCR avec des amorces spécifiques du transgène pour Ngn2 (en avant : TATGCACCTCACCTCCCCATAG ; Revers : GAAGGGAGGAGGGCGCTCGACT).
   5. À ce stade, congeler les stocks des nouvelles lignées NIL- et NIP-iPSC dans un milieu de congélation pour les iPSC humaines (voir le tableau des matières).

3. Différenciation des motoneurones

1. Dissocier les cellules à l’aide du réactif de dissociation cellulaire décrit (étapes 2.1.1.-2.1.3.). Prélever les cellules dissociées dans un tube de 15 mL et diluer avec 5 volumes de DMEM/F12. Granulez les cellules et mettez-les en suspension dans un milieu iPSC humain complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM. Comptez les cellules et les graines sur des boîtes enrobées de matrice à une densité de 62 500 cellules/cm².
2. Le lendemain, remplacez le milieu par du DMEM/F12, complété par 1 analogue stable de la L-glutamine, 1 supplément de culture cellulaire d’acides aminés non essentiels (NEAA) et 0,5 fois plus de pénicilline/streptomycine, contenant 1 μg/mL de doxycycline. Ceci est considéré comme le jour 0 de la différenciation. Le jour 1, rafraîchissez le médium et la doxycycline.
3. Le jour 2, remplacer le milieu par un milieu neurobasal/B27 (milieu neurobasal complété par 1x B27, 1x analogue stable de la L-glutamine, 1x NEAA et 0,5x pénicilline/streptomycine), contenant 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 et 1 μg/mL de doxycycline (voir le tableau des matériaux). Rafraîchissez le milieu et la doxycycline tous les jours jusqu’au jour 5.
4. Jour 5 : Dissociation cellulaire avec réactif de dissociation cellulaire (voir Tableau des matériaux).
   1. Rincez les cellules avec du PBS (sans Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (0,35 mL pour une boîte de 35 mm) et incuber à 37 °C jusqu’à ce que toute la monocouche cellulaire se sépare de la boîte.
      NOTEZ que les cellules individuelles ne seront pas séparées pendant l’incubation.
   3. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 et recueillir les cellules dans un tube de 15 mL.
   4. Complétez en douceur la séparation des cellules en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 10 à 15 fois.
   5. Ajouter 4 mL de DMEM/F12 et compter les cellules.
   6. À ce stade, congelez les progéniteurs des motoneurones dans un milieu de congélation cellulaire (voir le tableau des matériaux), selon les instructions du fabricant.
   7. Granulez les cellules et mettez-les en suspension dans un milieu neuronal (milieu neurobasal/B27 complété par 20 ng/mL de BDNF, 10 ng/mL de GDNF et 200 ng/mL d’acide L-ascorbique, voir le tableau des matériaux) complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM.
   8. Ensemencez les cellules sur de la poly-ornithine/laminine ou sur des supports recouverts de matrice à une densité de 100 000 cellules/cm². Utilisez des supports en plastique μ-Slide avec lamelle en polymère (voir le tableau des matériaux) pour l’analyse de l’immunomarquage.
5. Le jour 6, changez le milieu pour un milieu neuronal frais dépourvu d’inhibiteur de ROCK. Dans les jours suivants, rafraîchissez la moitié du support tous les 3 jours. Le milieu de culture doit être changé très soigneusement pour éviter qu’il ne se détache de la surface.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Réactif de dissociation cellulaire
B27	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-566	Supplément sans sérum pour l’entretien des cellules neuronales
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Milieu de congélation cellulaire, utilisé ici pour les progéniteurs des motoneurones
Le BDNF	PréproTech	Référence 450-02	Facteur neurotrophique dérivé du cerveau
Blasticidine	Sigma-Aldrich	Référence 203350	Antibiotique nucléosidique qui inhibe la synthèse des protéines chez les procaryotes et les eucaryotes
Bsa	Sigma-Aldrich	A2153	Albumine sérique bovine. Agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique d’anticorps dans des tests d’immunocoloration
CaCl2	Sigma-Aldrich	Réf. C3881	Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques
Matrice qualifiée hESC de Corning Matrigel	Corning	354277	Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques
FLUIDE DE CONGÉLATION CRYOSTEM ACF	Industries biologiques	Référence 05-710-1F	Milieu de congélation pour iPSC humaines
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inhibiteur de la gamma sécrétase
Dispase	Gibco	Référence 17105-041	Réactif pour la dissociation en douceur des iPSC humaines
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Milieu basal pour la culture cellulaire
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Utilisé pour induire l’expression de transgènes à partir des vecteurs epB-BSD-TT-NIL et epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Ligne commerciale iPSC humaine
GDNF	PréproTech	450-10	Facteur neurotrophique dérivé de la glie
Ligne hiPSC épisomale Gibco	Thermo Fisher Scientific	A18945	Ligne commerciale iPSC humaine
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Une alternative à la L-glutamine avec une stabilité accrue. Améliore la santé cellulaire.
Hepes	Sigma-Aldrich	N° H4034	Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques
Acide L-ascorbique	Laboratoires LKT	A7210	Utilisé en culture cellulaire comme antioxydant
Laminine	Sigma-Aldrich	11243217001	Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Acides aminés non essentiels. Utilisé comme complément pour les milieux de culture cellulaire, pour augmenter la croissance et la viabilité cellulaires.
Kit néon 100 μL	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Kit d’électroporation de cellules
Système de transfection au néon	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Système d’électroporation de cellules
Milieu neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Milieu basal conçu pour le maintien et la maturation à long terme des populations de cellules neuronales sans avoir besoin d’une couche nourricière d’astrocytes
NutriStem-XF/FF	Industries biologiques	Référence 05-100-1A	Milieu de culture iPSC humain
Pbs	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Tampon phosphate salin Dulbecco, avec calcium, magnésium
PBS Ca2+/Mg2+ gratuit	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampon salin phosphate Dulbecco's, sans calcium, sans magnésium
Pénicilline/streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Solution de pénicilline/streptomicine utilisée pour prévenir la contamination des cultures cellulaires par des bactéries.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	Réf. P4957	Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Inhibiteur sélectif du récepteur 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Réf. T8787	4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol, t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol, polyéthylèneglycol tert-octylphényléther. Utilisé pour la perméabilisation cellulaire dans les tests d’immunomarquage
Y-27632 (inhibiteur de ROCK)	Enzo Sciences de la Vie	ALX-270-333-M005	Inhibiteur sélectif perméable aux cellules de la protéine kinase (ROCK) associée à Rho. Augmente la survie des iPSC
μ-Slide 8 Puits	Ibidi	Référence 80826	Prise en charge de l’analyse microscopique haut de gamme des cellules fixes