Génération d’un modèle de co-culture 3D de fibroblastes et de neurones cornéens humains

Résumé

Source : Sharif, R., et al. Ingénierie tissulaire cornéenne : un modèle in vitro des interactions nerf-stromale de la cornée humaine. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo présente une technique permettant de générer un système de modèle de co-culture tridimensionnel de fibroblastes cornéens humains primaires et de cellules neuronales différenciées. Ce système de co-culture peut être utilisé pour étudier les interactions stromales-nerveuses.

Protocole

1. Culture primaire de HCF (fibroblastes cornéens humains) et assemblage de constructions 3D

1. Assembler des constructions 3D à partir d’explants préalablement cultivés dans EMEM 10 % FBS 1 % Antibiotique/Antimycosique, passage et comptage des HCF.
2. Ensemencer environ 1 x 10⁶ cellules/puits de HCF primaires sur des inserts de membrane en polycarbonate avec des pores de 0,4 μm à partir des constructions 3D, avec 1,5 mL d’EMEM frais 10 % FBS 1 % d’antibiotique/antimycosique au sommet de la construction. Ajoutez 1,5 mL du même média au bas de chaque construction.
3. Après 24 h d’ensemencement cellulaire, cultivez les cellules avec l’antibiotique/antimycosique EMEM 10 % FBS, stimulé avec 0,5 mM d’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbique (vitamine C) en ajoutant 1,5 mL sur le dessus et 1,5 mL sur le dessous de chaque construction.
4. Maintenez les cultures dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 3 semaines et fournissez des milieux frais tous les deux jours pendant toute la durée de l’étude. Il n’est pas nécessaire de passer d’autre message.

2. Différenciation cellulaire et co-cultures

1. Après 3 semaines, ajoutez 8 x 10^{cellules 3} cellules/puits de cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y sur les constructions 3D précédemment assemblées contenant 1,5 ml d’EMEM contenant 10 % de FBS, 1 % d’antibiotique/antimycosique et 0,5 mM d’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbique (vitamine C).
   1. Laissez les cellules du neuroblastome SH-SY5Y se développer au-dessus des cellules stromales de la cornée pendant au moins 24 heures avant d’initier la différenciation cellulaire.
2. Amorcez la différenciation cellulaire SH-SY5Y en stimulant les cellules avec EMEM contenant 1 % de FBS et 1,5 mL d’acide rétinoïque 10 μM sur le dessus de la construction. Ajouter 1,5 mL d’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbique 10 % FBS 10 % EMEM (vitamine C) au bas de la construction. Notez que l’étape de l’acide rétinoïque doit être effectuée dans l’obscurité.
   1. Continuez à cultiver les cellules dans ce milieu de différenciation pendant 5 jours.
3. Lorsque les cellules atteignent la phase de différenciation, passez à 1,5 mL de milieu sans sérum contenant 2 nM de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 1 % d’antibiotique/antimycosique ajouté à l’EMEM, en ajoutant au sommet de la construction. Ajouter 1,5 mL d’acide 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbique 10 % FBS 10 % EMEM (vitamine C) au bas de la construction. Notez que l’étape BDNF doit être effectuée dans l’obscurité.
4. Cultivez les cellules pendant 2 jours supplémentaires avant de les traiter pour une analyse plus approfondie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution tamponnée au phosphate de Dulbecco (1X)	Gibco par Life Technologies	Référence 14190 à 144
Pinces stériles	Fischer Scientific	Tél. : 13-812-42	Fisherbrand Pince à échardes à pointes extra-fines pour dissection
Lames de rasoir à simple tranchant	Personna	Référence 270100
Lames de scalpel chirurgical stériles n°10	Lame chirurgicale de plume	2976#10
Eagle's Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
Sérum fœtal bovin	Produits biologiques d’Atlanta	S11550	10 % de FBS est requis pour la préparation des supports
Antibiotique-Antimycosique (100X)	Gibco par Life Technologies	Référence 15240-062	Un antibiotique-antimycosique à 1 % est nécessaire pour la préparation des milieux
0,05 % de trypsine EDTA(1X)	Gibco par Life Technologies	25300062
Inserts de membrane en polycarbonate avec pores de 0,4 μm	Costar de Corning	Référence 3412
Acide 2-O-α-Dglucopyranosyl-L-ascorbique (vitamine C)	Sigma-Aldrich	SMB00390-14	Une concentration de 0,5 mM doit être utilisée pour l’étude
SH-SY5Y Cellules de neuroblastome	ATCC	SHSY5YATCC CRL-2266
Acide rétinoïque	Sigma-Aldrich	SRP3014-10UG	Une concentration finale de 10 uM doit être utilisée
Le BDNF	Sigma-Aldrich	Réf. R2625-100MG	Une concentration finale de 2 nM doit être utilisée
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	VWR-Alfa Aesar	Référence 67-68-5	DMSO stérile de qualité ultra pure à utiliser
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T25)	Fisher Scientific	Tél. : 12-565-351
Thermo Scientific Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks (T75)	Fisher Scientific	Tél. : 12-565-349