Immunomarquage tissulaire pour l’imagerie cytométrie de masse

Résumé

La vidéo décrit la préparation d’un échantillon de tissu pour l’imagerie par cytométrie de masse. Le tissu est d’abord traité pour démasquer les épitopes de l’antigène, perméabiliser les cellules et bloquer les sites de liaison des anticorps non spécifiques. Ensuite, le tissu est incubé avec un cocktail d’anticorps conjugués à des métaux et une coloration nucléaire. Enfin, l’échantillon de tissu traité est imagé à l’aide d’un scanner optique.

Protocole

1. Prétraitement tissulaire :

Pour les mouchoirs frais congelés :

1. Placez un bocal en verre Coplin dans le congélateur à -20°C pendant au moins une heure avant utilisation.
2. Sortez les lames du congélateur à -80°C et placez-les dans le bocal en verre Coplin du congélateur à -20°C pendant au moins 15 minutes.
3. Sous la hotte, utilisez un coupe-ampoule pour ouvrir l’ampoule en verre de paraformaldéhyde (PFA) à 16 %. Jetez le verre brisé de manière appropriée.
4. Ajouter 10 ml de PFA à 16 % et 30 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un bocal en plastique Coplin. Assurez-vous que le PBS est pré-refroidi à 4°C.
5. Transférez cette solution dans le réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 15 minutes.
6. Au bout de 15 minutes, transférez le bocal en verre Coplin avec les lames dans le réfrigérateur à 4°C pendant 10 minutes.
7. Transférez les lames du bocal en verre dans le bocal en plastique Coplin contenant la solution froide de PFA à 4 %.
8. Fixez les lames avec 4 % de PFA pendant 30 minutes à l’intérieur du réfrigérateur.
9. Rincez les lames trois fois dans du PBS à température ambiante pendant 5 minutes chacune, en assurant un rinçage complet entre les cycles.

Pour les tissus FFPE :

1. Commencez par les coupes de tissu de 5 μm fixées au formol et incluses dans la paraffine (FFPE) montées sur les lames de microscope standard chargées positivement.
2. Déparaffinez les lames en les chauffant à 60°C pendant une heure.
3. Retirez les lames et refroidissez-les à température ambiante pendant environ 5 minutes.
4. Placez les lames dans une enveloppe de diapositives et rincez-les dans un bain de xylène pendant 3 minutes, deux fois.
5. Encore une fois, rincez les lames avec de l’éthanol à 100 % pendant 1 minute, deux fois.
6. De même, rincez les lames à l’éthanol à 95 % et 70 % pendant 1 minute chacune.
7. Enfin, rincez une dernière fois à l’eau distillée pendant 3 minutes.
   note: L’Hypérion ne peut pas s’ablater à moins de 2 mm du bord de la glissière, centrez le tissu autant que possible.

2. Récupération d’épitopes induite par la chaleur (HIER)

1. Préparez le tampon pH9 de l’acide tris-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) :
   1. Le tampon Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER est acheté à 100x et dilué à 1x dans de l’eau de chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
   2. Ex : 2,5 ml d’Abcam ab93684 dans 247,5 ml d’eau HPLC.
      note: Il ne faut pas utiliser de tampon de plus de six mois.
2. Mettez en place une chambre de dévoilement pour chauffer les lames. Tout d’abord, remplissez le fond de la chambre avec 500 ml d’eau du robinet. Ensuite, ajoutez 250 ml d’eau du robinet dans les contenants latéraux et 200 ml d’eau du robinet dans le récipient central.
3. Placez jusqu’à 3 lames dans une enveloppe à 5 places.
4. Remplissez l’enveloppe de lames avec le tampon HIER jusqu’à ce que le tissu soit complètement immergé. note: Assurez-vous que l’enveloppe de diapositives a un petit trou dans le haut pour évacuer la vapeur et empêcher la pressurisation.
5. Exécutez le « Programme 4 » pendant 20 minutes à 95 °C.
6. Pendant ce temps, préchauffez les chambres d’incubation pour les étapes suivantes (voir l’étape 3.5)
7. Après l’incubation, retirez l’enveloppe et placez-la dans une baignoire avec de l’eau froide du robinet.
8. Laisser refroidir pendant 5 minutes.
9. Retirez la moitié du tampon de l’enveloppe et remplacez-la par de l’eau distillée. Laisser refroidir pendant 5 minutes.
10. Retirez progressivement le tampon et augmentez le volume d’eau deux fois, chacune avec une période de refroidissement de 5 minutes.
11. Enfin, rincez les lames à 100 % d’eau distillée.

3. Blocage de la liaison non spécifique

1. Préparez un tampon bloquant (solution saline tamponnée au tris ou TBS, 0,1 % de Triton X-100, 3 % d’albumine sérique bovine ou BSA) en ajoutant 150 uL de TBS avec 10 % de BSA à 350 uL de TBS avec 0,1 % de Triton X-10.
   note: Le TBS avec 10 % de BSA est stocké à -20 °C et doit être décongelé frais à chaque fois.
2. À l’aide d’une enveloppe de diapositives ou de pots Coplin, lavez les lames pendant 5 minutes dans du TBS, 0,1 % de Triton X-100 deux fois.
3. Retirez la diapositive de l’enveloppe et utilisez une lingette Kim pour retirer toute mémoire tampon à l’extérieur du cercle PAP. Laisser sécher légèrement ~1 minute.
4. À l’aide d’un P200, ajoutez quelques gouttes du tampon de blocage sur le tissu, juste assez pour le couvrir. La ligne PAP doit maintenir le liquide sur le tissu.
   note: Si le tampon n’est pas confiné dans le cercle PAP, redessinez le cercle PAP autour du tissu pour éviter la perte d’anticorps plus tard.
5. Incuber la lame à température ambiante dans une chambre humide pendant 1 heure.
   note: Une boîte d’embout de pipette vide fonctionne bien pour une chambre d’humidité. Assurez-vous qu’une petite quantité d’eau du robinet est présente au fond.

4. Coloration avec des anticorps conjugués aux métaux

1. Retirer les anticorps conjugués au métal à 4 °C et centrifuger à 10 000 x G pendant 1 minute.
2. Préparation de la dilution optimale du mélange maître d’anticorps dans un mélange de TBS, de Triton X-100 à 0,1 % et de BSA à 1 %.
   REMARQUE : a) La dilution optimale de chaque anticorps doit être déterminée expérimentalement et constitue l’une des étapes les plus critiques pour la réussite des expériences de cytométrie de masse par imagerie. Utilisez une feuille de calcul Excel pour calculer les volumes. Ne produisez qu’un peu plus que ce qui est nécessaire en raison du coût des anticorps. Par exemple, s’il a fallu 200 uL de tampon de blocage, faites un master mix de 250 uL. b) Le mélange maître doit être préparé frais pour chaque expérience pendant l’étape de blocage.
3. Après l’incubation (voir l’étape 3.5), retirez la lame de l’incubateur.
4. Retirez l’excès de tampon de blocage en tapotant la diapositive verticalement et horizontalement sur les lingettes Kim. Cela devrait laisser un tampon bloquant sur le tissu, mais en éliminera la majeure partie.
5. Laisser sécher légèrement ~1 minute.
6. Placez la lame dans la chambre d’humidité à 4°C et laissez-la s’équilibrer.
7. Ensuite, pipetez soigneusement le mélange maître d’anticorps sur le tissu, en faisant extrêmement attention à ce que la solution soit contenue dans le cercle PAP.
8. Fermez la chambre d’humidité et incubez une nuit à 4°C.
9. Après une nuit d’incubation, retirer la lame à 4 °C et retirer l’excédent de mélange maître en tapotant la lame verticalement et horizontalement sur les lingettes Kim.
10. Placez la lame dans l’enveloppe ou le bocal Coplin ; lavez-la pendant 5 minutes avec une solution saline tamponnée au phosphate ou du PBS, complétée par 0,2 % de Triton X-100, deux fois.
11. Ensuite, lavez la lame dans du PBS pendant 5 minutes, deux fois. Retirez la lame et laissez-la sécher pendant environ 1 minute.

5. Intercalation de l’ADN

1. Pour l’intercalation de l’ADN, diluer l’Intercalator-Ir 1:1000 dans PBS.
2. Pipetez soigneusement l’intercalateur dilué sur le tissu, en faisant extrêmement attention à ce que la solution soit contenue dans le cercle PAP.
3. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans la chambre d’humidité utilisée pour le blocage.
4. Après cela, tapotez les lames verticalement et horizontalement sur les lingettes Kim pour éliminer l’excès de colorant Intercalator-Ir.
5. Placez la lame dans l’enveloppe ou le bocal Coplin et lavez-la deux fois avec de l’eau HPLC pendant 5 minutes chacune.
6. Faites sécher les lames dans un dessiccateur pendant 5 minutes avant de les scanner.

6. Analyse des images

1. Pour la numérisation de diapositives, utilisez un graveur de verre à pointe de carbure pour gratter quatre X pâles dans la diapositive. Des points d’apprentissage précis permettront le meilleur enregistrement de l’image.
   note: Ne vous approchez pas trop du bord.
2. Numérisez à l’aide d’un scanner de documents à plat à pas moins de 1200 points par pouce
3. Recadrez cette image aussi près que possible des bordures des diapositives et enregistrez-la sur une clé USB.
4. Pour le co-enregistrement d’image, numérisez la diapositive sur un Hamamatsu NanoZoomer avec « Pre_IMC » dans le nom de fichier.

Résultats

Graphique 1 : Représentation schématique de la procédure d’immunomarquage tissulaire pour l’imagerie de la cytométrie de masse

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Équipements
Bocaux Coplin
Enveloppe en plastique à 5 lames avec trou d’aération
Dispositif de récupération d’antigène (chambre de démasquage)
scanneur
Produits chimiques et enzymes :
xylène
Éthanol à 200 degrés
Eau HPLC
Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer
Tbs
TBS avec 0,1 % Trition X-100
TBS avec 10 % de BSA
Pbs
PBS avec 0,2 % Trition X-100