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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la tranche
- Construire ou obtenir une chambre de récupération de tranches.
REMARQUE : Le principe d’une chambre de récupération est simple et peut être réalisé en laboratoire (Figure 1). En bref, la chambre est un réceptacle dans lequel un panier est inséré pour maintenir les tranches de cerveau à un niveau inférieur à la surface du liquide céphalo-rachidien artificiel (LCR).
- À titre d’exemple, obtenez quatre anneaux (4 à 6 mm de haut) (Figure 1A, vue latérale ; B, vue de dessus) en coupant une seringue de 30 cc. Ensuite, collez des filets étirés (p. ex., coupés dans un tuyau en nylon) sur un côté des anneaux pour maintenir les tranches de cerveau (figure 1B) et collez les anneaux ensemble.
REMARQUE : Un pistolet à colle peut être utilisé.
- Une fois les quatre anneaux collés, collez une paroi en plastique incurvée en forme de trapèze isocèle à deux des anneaux (figures 1A et B) pour détourner les bulles d’oxygène des tranches de cerveau en récupération (figures 1C et D). Comme le montre la figure 1D, insérez un système de diffusion d’oxygène (ici, un tube de dispersion de gaz) du même côté que les parois en plastique.
- Avant le tranchage, oxygénez (95 % O2/5 % CO2) et refroidissez la solution de tranchage (voir étape 1.4) à 0 - 2 °C.
- Remplissez la chambre de récupération personnalisée avec de l’aCSF standard à température ambiante (RT). Assurez-vous que le LCR est bien oxygéné (20 à 30 min, le temps peut varier en fonction du volume de la chambre) avant de placer les tranches dans la chambre de récupération. Assurez-vous que les bulles de gaz n’entrent pas en contact direct avec les tranches ou ne les perturbent pas.
- Tapissez le bac à glaçons du vibratome de glaçons et remplissez-le d’eau froide de manière à ce qu’un tiers à la moitié de la chambre de tranchage soit immergé. Placez soigneusement un système d’administration d’oxygène (par exemple, une pierre diffusant du gaz) et une sonde de température dans la chambre de tranchage afin qu’aucun élément n’interfère avec le mouvement de la lame ou la manipulation de la tranche.
- Préparez la zone de dissection et les outils nécessaires à l’extraction du cerveau et à la dissection de la région cérébrale souhaitée.
REMARQUE : La dissection exacte effectuée dépendra de la région cérébrale spécifique étudiée, car différentes structures cérébrales nécessiteront un tranchage à différents plans (par exemple, coupes coronales, sagittales ou horizontales).
- Placez les outils suivants sur un sous-matelas : ciseaux de décapitation, scalpel, petits ciseaux droits à pointe pointue, pince à canulation de vaisseau (ou tout outil chirurgical à pointe large, comme les rongeurs, qui convient mieux aux crânes de rats), pince hémostatique incurvée, pince à épiler, spatule, spatule à ramasser, papier filtre, boîte de Pétri, lame de rasoir à un seul tranchant et colle cyanoacrylate.
- Lorsque la température atteint 0-2°C, transférez la solution de tranchage dans la chambre de tranchage (plateau tampon).
- Anesthésie la souris dans une chambre de dessiccation à l’aide d’isoflurane. La quantité exacte peut varier en fonction de la taille de la chambre utilisée, mais pour une petite cage de boîte à chaussures, utilisez quelques gouttes (~3-4). Laissez la souris dans la cage jusqu’à ce qu’elle soit immobile (ne répondant pas aux stimuli tactiles ; environ 15 secondes pour les conditions décrites ici). Effectuez des tests de pincement de la queue et du pied pour vous assurer que l’animal est profondément anesthésié, puis décapitez-le avant que le cœur ne cesse de battre (améliore la viabilité cellulaire).
REMARQUE : Sur justification appropriée, certains laboratoires obtiennent l’autorisation d’effectuer la décapitation à vif afin de minimiser autant que possible les processus excitotoxiques et d’améliorer la viabilité cellulaire.
- Effectuez la dissection.
REMARQUE : L’extraction rapide du cerveau (<45 sec).
- À l’aide du scalpel, la peau superficielle du crâne s’étend du rostral au caudal.
- Pelez le cuir chevelu de chaque côté de la tête.
- À l’aide de petits ciseaux droits à pointe pointue, coupez la plaque interpariétale le long de la suture lambdoïde pour retirer le cervelet. Retirez l’os occipital.
- À l’aide des mêmes ciseaux, coupez la suture sagittale.
- Faites glisser la pince à canulation du vaisseau (ou rongeurs si vous brisez le crâne d’un rat) sous chaque os pariétal et tirez pour exposer le cerveau.
- À l’aide de la pince hémostatique incurvée, pincez les os frontaux pour les casser, puis utilisez une pince à épiler ou une pince à canulation pour retirer les os cassés. Coupez et retirez la dure-mère aussi doucement que possible, car elle peut interférer avec la dissection.
- Faites glisser la spatule sous le cerveau et retirez-la doucement du crâne. Placez-le dans la chambre de tranchage (bac tampon) préalablement remplie d’aCSF glacé. Laissez le cerveau refroidir pendant 1 à 2 minutes.
- Préparez la plate-forme de dissection en remplissant une boîte de Pétri avec de la glace et un peu d’eau glacée pour permettre un meilleur contact de surface. Couvrez le plat avec son couvercle et placez du papier filtre sur le dessus. Mouillez le papier filtre avec de l’aCSF froid.
- Une fois le cerveau refroidi, placez-le sur la boîte de Pétri remplie de glace et effectuez rapidement la dissection appropriée pour obtenir le plan de tranchage souhaité.
- Pour obtenir des tranches sagittales contenant le noyau accumbens (NAc), utilisez une lame de rasoir à un seul tranchant pour couper et retirer les tubercules olfactifs et le cervelet s’ils sont encore présents. Ensuite, effectuez une coupe sagittale de 2-3 mm à partir du bord latéral de l’hémisphère droit pour obtenir la surface plane qui sera collée sur la plaque de support de l’échantillon (voir étape 1.8.11).
REMARQUE : Couper seulement 2 à 3 mm du bord latéral de l’hémisphère permettra de collecter des tranches contenant le NAc des deux hémisphères. La dissection appropriée dépendra de la région du cerveau étudiée. Ici, la dissection est effectuée afin que les neurones NAc puissent être enregistrés dans des coupes de cerveau sagittales.
- Collez rapidement (à l’aide de colle cyanoacrylate appliquée sur la plaque de maintien de l’échantillon) la surface de coupe plate du cerveau sur la plaque selon le plan de tranchage souhaité. Pour obtenir des coupes de cerveau sagittal, voir l’étape 1.8.10.
- Placez et fixez immédiatement la plaque de support de l’échantillon dans la chambre de tranchage de manière à ce que le cerveau soit tranché rostro-caudalement (pour plus de sécurité, ne placez le porte-lame que lorsque la plaque de l’échantillon est fixée).
- Réglez le vibratome avec les paramètres de tranchage appropriés (paramètres utilisés en laboratoire pour le vibratome mentionné dans les matériaux : vitesse 3 - 4, vibration 9-10 et épaisseur de la tranche 250 μm).
- Après le tranchage, utilisez une pipette de transfert garnie de plastique pour transférer les tranches de cerveau dans la chambre de récupération (à RT) (voir étape 1.3). Le temps de récupération peut varier en fonction du type de neurone étudié (généralement de 30 à 90 minutes).
2. Enregistrement des micropipettes et préparation du rig
- Reportez-vous aux directives spécifiques du manuel d'utilisation de l'extracteur pour obtenir les propriétés de micropipette souhaitées.
REMARQUE : Pour les MSN, nous utilisons une plage de résistance de pipette de 3,2 à 4,0 MΩ.
- Oxygéner l’aCSF et ajuster le débit à 2 ml/min. Mettre sous vide l’aCSF à l’aide d’une pompe péristaltique ou de conduites de vide installées dans l’établissement.
- Allumez le régulateur de perfusion et ajustez les réglages de température afin d’obtenir la température souhaitée (par exemple, 31,8-32,2 °C).
REMARQUE : La stabilité de la température dépend d’un niveau constant d’aCSF et d’une vitesse d’écoulement constante dans la chambre. Étant donné que plusieurs propriétés biophysiques des neurones (par exemple, la résistance d’entrée, Ri, également appelée résistance membranaire, Rm) sont sensibles à la température, il est important de maintenir une température stable.
- Allumez l’amplificateur contrôlé par ordinateur, la caméra, le micromanipulateur et la lumière d’arrière-plan du microscope. Si vous effectuez une expérience qui nécessite une stimulation électrique du tissu, allumez le contrôleur de stimulus et l’unité d’isolement.
REMARQUE : Certains amplificateurs d’autres fabricants recommandent un « préchauffage » avant utilisation, il est donc recommandé de consulter le manuel pour la procédure d’utilisation exacte.
- Démarrez les logiciels de capture de caméra, d’acquisition de signaux et d’amplification.
- Placement et visualisation des tranches :
- À l’aide d’une pipette de transfert en plastique à pointe taillée, prélevez doucement une tranche de cerveau de la chambre de récupération.
- Placez la pipette de transfert dans la chambre d’enregistrement et pressez doucement la tranche de la pipette sur la lamelle qui tapisse le fond de la chambre.
REMARQUE : Tant qu’il n’y a pas de débordement, il est inoffensif d’avoir un peu d’aCSF de la chambre de récupération se déversant dans le bain.
- À l’aide d’une pince, modifiez la position de la tranche afin que la zone souhaitée soit placée exactement au centre de la chambre d’enregistrement. Utilisez l’objectif du microscope basse consommation (4X) et l’oculaire pour vous aider à vous positionner.
- Une fois que la position souhaitée a été atteinte, fixez la position de la tranche de cerveau à l’aide d’un dispositif de maintien de la tranche (également appelé « harpe ») dans la chambre.
- Passez à un objectif haute puissance (40X) et abaissez-le doucement jusqu’à ce qu’un contact se forme avec l’aCSF dans la chambre.
- Utilisez la molette de réglage fin pour faire la mise au point sur le tissu. En cas de contact avec l’aCSF, n’utilisez pas la molette de réglage grossière du microscope car une baisse excessive de la lentille de l’objectif peut écraser la tranche ou même briser la lamelle recouvrant le fond de la chambre, ce qui peut faire en sorte que l’aCSF se déverse sur le condenseur et l’endommage.
- Lorsque l’accent est mis sur le tissu, observez la forme des cellules de la région ciblée. Les cellules mortes sont facilement identifiables par leur membrane plasmique et leur noyau gonflés (Figure 1E). Les cellules saines doivent se présenter sous la forme de structures homogènes rondes, ovoïdes ou elliptiques (Figure 1E).
- Recherchez une cellule cible. Marquez-le sur l’écran de l’ordinateur afin d’aider à guider la micropipette d’enregistrement. Si vous utilisez un logiciel tel que QCapture, dessinez un carré autour de la cellule cible en maintenant le clic gauche de la souris.
- Soulevez la lentille de l’objectif de manière à ce qu’il y ait suffisamment d’espace dans le cône formé par la lentille de l’objectif en contact avec l’aCSF pour placer et déplacer la micropipette enregistreuse.
- Placement et positionnement des micropipettes
- À l’aide d’une seringue de 1 ml, d’une aiguille de microseringue non métallique et d’un filtre dédié, remplissez une micropipette avec la solution interne préparée à l’avance selon l’expérience prévue (solution interne à base de K+ ou de Cs+, voir Matériaux pour la composition). Utilisez suffisamment de solution pour que la solution interne entre en contact avec l’électrode en fil d’argent enrobée de chlorure à l’intérieur du support de micropipette.
REMARQUE : L’électrode en fil d’argent peut être chlorée en la trempant dans de l’eau de Javel domestique. Des nucléosides triphosphates (adénosine triphosphate, ATP et guanosine triphosphate, GTP) peuvent être ajoutés à la solution interne avant utilisation. Conservez la seringue contenant la solution sur de la glace pour éviter la dégradation de l’ATP/GTP.
- Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la micropipette car elles peuvent sortir pendant que la micropipette est dans le tissu et obscurcir la tranche.
- Placez la micropipette dans le porte-électrode de manière à ce que la solution entre en contact avec le fil-électrode recouvert de chlorure d’argent.
- Serrez le capuchon de la pipette de manière à ce que la rondelle du cône forme un joint autour de la micropipette.
- Appliquez une pression positive avant d’immerger la micropipette dans l’aCSF pour éviter que des débris ne pénètrent dans la pipette.
- Placez le headstage en position verrouillée (face à la chambre) et, à l’aide du micromanipulateur, guidez-le vers le bas vers la chambre afin qu’il soit à peu près sous le centre de l’objectif immergé.
- Tout en déplaçant la micropipette à l’aide du micromanipulateur (réglé à vitesse moyenne à élevée), utilisez l’écran de l’ordinateur pour localiser la micropipette et la guider vers l’emplacement de la cellule sur l’axe X-Y.
- Mesurez la résistance de la micropipette en appliquant un pas de tension (par exemple, 4 mV pour 100 ms), ce qui peut être réalisé manuellement ou automatiquement via un logiciel spécifique tel que le mode « bain » si vous utilisez le « test de membrane » dans le logiciel Clampex (voir également l'étape 4). Afin de s’assurer qu’aucune bulle d’air ou tout autre objet étranger ne bloque la micropipette, appliquez une pression positive à l’aide de la seringue remplie d’air (par exemple, une seringue de 30 cc) reliée au porte-micropipette par un tube en polyéthylène.
- Après avoir nettoyé la micropipette, effectuez un décalage de tension pour réduire le courant de la pipette à zéro, ce qui peut être accompli manuellement ou via un logiciel spécifique tel que le « décalage de pipette » sur l'amplificateur contrôlé par ordinateur commander.
REMARQUE : Cette fonction compensera toute tension causée par les différences de concentration entre le bain et les solutions de micropipette (c’est-à-dire le potentiel de jonction liquide).
3. Test membranaire
REMARQUE : Cette étape s’applique à l’amplificateur mentionné dans les Matériaux.
- Lorsque vous utilisez une commande d’amplificateur commandée par ordinateur, réglez-la toujours en mode pince de tension pour effectuer le test de membrane.
REMARQUE : Lorsque le test à membrane est réglé en mode « Bain », le test à membrane permet de mesurer la résistance de la micropipette et la résistance du joint lorsque le joint est formé.
- Une fois la membrane rompue (voir étape 4.8), passez le test de membrane en mode « Cellule » afin d’obtenir la résistance série (Rs) (également appelée résistance d’accès, Ra), Ri et la capacité membranaire (Cp).
4. Approche finale, formation du joint et obtention de la configuration de la cellule entière
- À l’aide de la molette de mise au point fine, commencez à faire la mise au point vers le bas tout en abaissant la micropipette progressivement. Faites toujours la mise au point en premier, puis abaissez la micropipette jusqu’au plan de mise au point. Cela garantira que la pointe de la micropipette ne pénétrera pas brusquement dans la tranche.
- Lorsque la micropipette entre en contact avec la surface de la tranche, ralentissez la vitesse du micromanipulateur en mode moyen-bas.
- Appliquez doucement une légère pression positive avec la seringue remplie d’air reliée au porte-pipette pour éliminer tous les débris de la trajectoire d’approche.
- Approchez-vous de la cellule soit en alternant avec les boutons de commande X-Y-Z, soit en vous approchant en diagonale (si le modèle de micromanipulateur le permet) où les deux axes X-Z sont modifiés avec la rotation du bouton de l’axe Z. Cette dernière méthode empêchera la compression verticale des tissus.
REMARQUE : Ici, le but est de s’approcher de la cellule en infligeant un minimum de dommages à la tranche. Lorsque la micropipette est suffisamment proche de la cellule, une fossette apparaît (une décoloration ronde de la surface de la cellule causée par la pression positive appliquée à travers l’extrémité de la micropipette) (Figure 2).
- Lorsque la fossette apparaît (Figure 2-1), appliquez une aspiration faible et brève à travers le tube relié au tube d’aspiration du porte-pipette afin de créer l’étanchéité (Figure 2-2). Continuez à surveiller le test de membrane.
REMARQUE : Si un joint partiel est formé (<1 GΩ), l’injection de courants négatifs en abaissant le potentiel de maintien (sur la commande d’amplification contrôlée par ordinateur) peut faciliter la formation du joint et atteindre une résistance de l’ordre du gigaohms (« joint gigaohm » ou « gigaseal » >1 - 5 GΩ). La haute résistance du joint (>1 GΩ) permettra à la fois de limiter la contamination sonore du signal enregistré et de contribuer à la stabilité mécanique du patch.
- Pendant la formation d'un gigaseal, utilisez le contrôleur d'amplification contrôlé par ordinateur pour rapprocher le potentiel de rétention de la cellule aussi près que possible du potentiel de repos physiologique (repos en V) afin d'éviter les changements soudains une fois la membrane rompue. Par exemple, les MSN sont généralement voltage-clampés à -70 ou -80 mV (repos en V physiologique : -70 à -90 mV).
- Une fois le gigaseal formé, compensez manuellement ou automatiquement la capacité rapide et lente. Si vous utilisez une commande d'amplificateur contrôlée par ordinateur telle que la commande Multiclamp, appuyez sur « Auto » pour « Cp Fast » et « Cp Slow ».
- Si le joint reste stable et supérieur à 1 GΩ (ou en injectant moins de 10 à 20 pA pour maintenir la cellule au potentiel de membrane souhaité), appliquez une aspiration brève et forte à travers le même tube qu’en 4.5 pour rompre la membrane plasmique (Figure 2-3).
REMARQUE : Cela peut prendre plusieurs essais. Une bonne rupture membranaire est obtenue lorsque l’aspiration est effectuée suffisamment fortement pour que la membrane rompue n’obstrue pas la micropipette (ce qui peut entraîner une augmentationde R s pendant l’enregistrement), mais suffisamment faible pour ne pas aspirer une grande partie de la membrane ou de la cellule.
- Après avoir réussi une configuration de cellule entière, surveillez régulièrement l’emplacement de la micropipette pour évaluer et corriger la dérive significative qui pourrait entraîner la perte du patch. L’amplitude de dérive peut varier en fonction de plusieurs facteurs, par exemple la qualité de l’installation de l’engin et les forces de traction sur la tête. Idéalement, la dérive devrait être presque inexistante.
- En passant en mode « Cellule » dans le test de membrane, visualisez différents paramètres de la cellule tels que Ri, Rs et Cp. Surveillez ces paramètres pendant l’enregistrement.
REMARQUE : Tous ces paramètres peuvent aider à évaluer l’état de santé initial des cellules et des types de cellules (voir la section « Test membranaire », étape 4).
