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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des solutions
- Le liquide céphalo-rachidien artificiel standard (ACSF ; Tableau 1)
- Utilisez des sels de haute pureté et des béchers en verre propres préalablement rincés avec de l’eau bi-distillée pour préparer une solution fraîche. Utilisez de l’eau bidistillée de haute qualité pour la préparation de toutes les solutions extracellulaires et intracellulaires.
- Selon le tableau 1, prendre un bécher de 2 L pour dissoudre le NaHCO3 dans 500 mL d’eau et un autre pour dissoudre les autres sels afin d’éviter la précipitation des ions divalents. Nettoyez systématiquement la spatule avec de l’eau bi-distillée et séchez-la avant de prendre un sel. Utilisez un agitateur magnétique pour homogénéiser la dissolution. Ajouter les solutions des deux béchers dans une fiole jaugée appropriée et les amener au volume approprié.
- S’assurer que la solution extracellulaire finale est entièrement transparente et sans aucune trace de précipitation.
- Appliquer un mélange gazeux composé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2 (gaz carbogène) à l’aide d’une bougie microfiltre en verre (Ø 13 mm) 20 à 30 min avant de perfuser les tranches. Contrôlez soigneusement l’osmolarité (2 à 3 mesures consécutives) de l’ACSF à l’aide d’un osmomètre (plage optimale : 314 - 325 mOsmol/L). Conservez le reste de la solution après préparation à 4 °C et utilisez-la dans les 3 jours.
- Solution de coupe (saccharose-ACSF ; Tableau 2)
- Préparez 3 L de solution fraîche. Utilisez 1 L pour préparer des tranches de cerveau d’un animal. Conservez le reste de la solution à 4 °C et utilisez-la dans les 3 jours.
REMARQUE : Des concentrations élevéesde Mg 2+ et de faible concentration de Ca2+ sont utilisées pour diminuer la transmission synaptique, et une partie du NaCl est remplacée par du saccharose pour préserver le tissu.
- Solutions intracellulaires
- Préparez à l’avance une solution de 100 ml pour les enregistrements à deux cellules entières (tableau 3).
- Inclure du méthylsulfate pour obtenir une bonne récupération de la morphologie cellulaire. Ajoutez de la biocytine (0,1 à 0,4 %) pour examiner la morphologie du neurone par la suite. Incluez un colorant fluorescent (par exemple, Alexa 594 ou Sulforhodamine 101 41) pour suivre l’extension des dendrites pendant l’enregistrement (facultatif).
- Préparez à l’avance une solution d’électrode de 100 mL pour les enregistrements sur cellule (tableau 4). Dans ce cas, la solution interne est une solution à K+ élevé conçue pour isoler le courant cationique macroscopique activé par l’hyperpolarisation (Ih) et contient des bloqueurs pour les autres canaux ioniques voltage-dépendants.
- Conserver les solutions intracellulaires dans des aliquotes de 2 mL à -20 °C. Utiliser une nouvelle aliquote pour chaque nouvelle session d’enregistrement. Vérifiez soigneusement l’osmolarité de chaque aliquote décongelée à l’aide d’un osmomètre. Prélever une nouvelle aliquote si l’osmolarité ne correspond pas à la valeur initiale.
- Transvaser la solution de l’aliquote dans une seringue de 3 mL sur laquelle un filtre de seringue stérile de 0,22 μm est placé. Maintenir la seringue sur de la glace pendant la session d’enregistrement pour limiter la dégradation de ses composés (ATP, GTP ou phosphocréatine).
2. Fabrication et remplissage de pipettes patch
- tirage
- Utilisez un extracteur d’électrode horizontal et un tube en verre borosilicate à paroi épaisse. Pour les enregistrements à cellules entières et attachés à une cellule, utilisez un diamètre extérieur de 2 mm / 1 mm de diamètre intérieur. Assurez-vous que le tube de verre est absolument propre.
- Si ce n’est pas le cas, immergez d’abord les capillaires de verre dans un solvant organique (par exemple, l’éthanol), puis dans de l’eau doublement distillée. Chauffez brièvement les extrémités capillaires avec un bec Bunsen. Vous pouvez également commander des tubes en verre lavés et chauffés directement auprès du fabricant (voir la liste des matériaux).
- Pour les enregistrements somatodendritiques doubles, assurez-vous que la résistance de la pipette somatique est comprise entre 6 et 10 MΩ et entre 8 et 19 MΩ pour les pipettes dendritiques lorsqu’elles sont remplies de solution intracellulaire (Tableau 3). Normaliser la résistance de la pipette pour les enregistrements attachés aux cellules à une résistance de 10 MΩ afin d’obtenir des résultats comparables le long du domaine somatodendritique du neurone.
- Préparez des pipettes neuves avant chaque session d’enregistrement (tous les jours) ou immédiatement avant le patchage et utilisez-les 5 à 8 heures après leur fabrication. Rangez les pipettes dans un récipient en verre couvert pour les protéger de la poussière et de l’obstruction de la pointe.
- polissage
- Inspectez et polissez thermiquement chaque pointe de pipette à l’aide d’une microforge pour obtenir une meilleure étanchéité avec la membrane. Avant d’utiliser la microforge, faites fondre un petit morceau de verre sur le filament chauffant en platine. Remplacez quotidiennement ce revêtement de verre sur le filament de platine pour plus de constance (Peter Jonas, communication personnelle).
note: Les pipettes utilisées pour les enregistrements attachés aux cellules peuvent être enduites avant l’étape de polissage à chaud afin de réduire le bruit de fond. Un agent isolant tel que de la cire dentaire fondue ou un élastomère de silicone peut être utilisé pour enrober les pipettes.
3. Préparation des tranches de cerveau
- Utilisez des rats Wistar sains âgés de 16 à 19 jours. N’utilisez pas d’animaux en mauvaise santé ou souffrant d’hypothermie ou de déshydratation. Avant de commencer la préparation des tranches, gardez l’animal dans un endroit sûr et silencieux. Évitez d’avoir d’autres animaux dans la pièce pendant la préparation d’un animal. Manipulez les animaux avec douceur.
- Versez le saccharose-ACSF dans deux béchers en polypropylène (PP) de 400 mL et placez-les au congélateur à -80 °C pendant 45 min. Mélangez la solution pour obtenir une solution liquide/congelée glacée homogène et placez les béchers sur de la glace. Alimenter la solution de saccharose-ACSF avec du gaz carbogène à l’aide d’une bougie à microfiltre (Ø 13 mm) dans chaque bécher en PP.
- Préparez la trancheuse et la chambre de réserve
- Utilisez une trancheuse à tissus de haute qualité avec des vibrations verticales extrêmement faibles afin de minimiser autant que possible les dommages aux couches superficielles des tranches. Fixez une lame de rasoir fraîche et entière sur la trancheuse.
- Utilisez une nouvelle lame de rasoir pour chaque séance de coupe. Évitez de plier la lame du rasoir. Ne retirez pas le film graisseux à la surface de la lame du rasoir (Josef Bischofberger, communication personnelle).
- Si possible, vérifiez les vibrations verticales à l’aide d’une vibrosonde fournie par le fabricant. Vous pouvez également utiliser une vibrosonde sur mesure. Réduire les vibrations verticales de la lame de manière à être le plus proche possible de 0 μm.
- Préparez une chambre de réserve de 150 mL pour les tranches. Versez l’ACSF standard dans la chambre de réserve et placez-le dans un bain-marie. Alimenter la solution de la chambre de réserve en carbogène à l’aide d’une bougie à microfiltre (Ø 6 mm). Veillez à ce que les bulles de carbogen soient aussi petites que possible.
note: Construisez une nouvelle chambre de réserve tous les 2 à 3 mois pour maintenir la qualité de la tranche constante.
- Couper des tranches
- Dans une pièce silencieuse dans laquelle l’expérimentateur n’est pas dérangé ou stressé, décapitez l’animal avec des ciseaux chirurgicaux (longueur 150 mm) au niveau de la moelle cervicale.
- Coupez la peau au sommet de la tête de l'animal dans le sens nasal à caudal avec un scalpel et retirez-la latéralement. Coupez le haut du crâne de la partie caudale à la partie nasale de la tête avec des ciseaux fins et retirez les deux parties du crâne latéralement. Retirez la cervelle à l’aide d’une spatule fine et déposez-la délicatement dans un bécher en PP contenant du saccharose-ACSF glacé (0 - 4 °C) équilibré avec du carbogène.
note: Cette séquence d’étapes doit être effectuée le plus rapidement possible, mais aussi méticuleusement (<<1 min, environ 40 s).
- Gardez le cerveau dans la solution du bécher en PP pendant ~2 à 5 min. Ajustez la pression du carbogen pour éviter les mouvements du cerveau. Si les bulles de carbogen sont trop grosses, remplacez la bougie à microfiltre par une bougie neuve.
- Placez le cerveau sur une boîte de Pétri de 9 cm dont le fond intérieur est recouvert d’une couche Sylgard de ~0,5 cm d’épaisseur. Préparez cette boîte de Pétri à l’avance.
- Entourez le cerveau de saccharose-ACSF glacé. Assurez-vous qu’une partie de la phase liquide de la solution ACSF-saccharose submerge le cerveau. Pour les tranches coronales, coupez la partie frontale du cerveau dans le plan coronal avec un scalpel ou une lame de rasoir. Retirez le cervelet avec une coupe coronale.
- Appliquez de la colle cyanoacrylate sur le plateau à échantillons (surface ~1 cm2). Collez le bloc cérébral de manière à ce que la partie frontale fasse face à l’étape de tranchage. Versez soigneusement du saccharose-ACSF sur le cerveau collé à l’aide de la grande ouverture d’une pipette Pasteur en verre, puis immergez lentement la chambre de coupe de la trancheuse. Manœuvrez le plateau d’échantillon de manière à ce que la surface de coupe (c’est-à-dire le premier tissu à frapper la lame) soit la surface ventrale du cerveau.
- Appliquez le carbogène à l’aide d’une bougie à microfiltre en verre courbé (Ø 6 mm) dans la chambre de coupe (en option).
- Ajustez la lame de rasoir à un angle de ~15° par rapport au plan horizontal. Couper des coupes de cerveau coronaire de ~500 μm dans le sens caudal à nasal avant d’atteindre la substance noire. Diminuez l’épaisseur pour couper des tranches de 300 à 350 μm d’épaisseur contenant la région d’intérêt.
- Séparez les tranches du bloc de tissu à l’aide d’une aiguille de perfusion très fine attachée à une seringue parallèle au bord de la lame du rasoir. Pliez l’aiguille de manière à avoir un angle de 90° entre l’aiguille et la seringue. Assurez-vous qu’aucune pression n’est appliquée sur la lame du rasoir lors du retrait de la tranche du bloc de tissu.
- Stocker des tranches
- Transférez les tranches à l’aide de la plus grande ouverture d’une pipette Pasteur en verre (fixée à une ampoule) dans la chambre de réserve. Une fois que toutes les tranches sont transférées dans la chambre de réserve (Christoph Schmidt-Hieber, communication personnelle), portez la température du bain-marie à 34 °C pendant 0,5 à 1 h.
- Après cette période, éteignez le bain-marie et conservez les tranches à température ambiante. Ajustez la pression du carbogen afin d’éviter les mouvements des tranches dans la chambre de réserve. Conservez les tranches pendant encore 10 à 20 minutes avant de commencer les enregistrements.
- Nettoyez soigneusement mais soigneusement l’équipement et les bougies à microfiltre avec de l’eau doublement distillée à la fin de la procédure de tranchage.
4. Enregistrements somatiques et somatodendriques doubles dans les neurones nigraux et le dépôt de biocytine
- Suivez les descriptions pour l’assemblage d’une configuration de patch-clamp pour les tranches données dans The Axon Guide.
- Préparer la chambre d’enregistrement
- Placez 1 à 2 mL d’eau doublement distillée dans la chambre d’enregistrement. Vérifiez qu’il n’y a pas de fuite. Placez la chambre d’enregistrement sur la table x-y décalée.
- Alimenter l’ACSF standard à travers un système de tubulure de perfusion imperméable à l’oxygène (polytétrafluoroéthylène) jusqu’à la chambre d’enregistrement. Stabiliser le débit de perfusion dans la chambre à un débit de 4 à 5 mL min-1. Maintenez la longueur du tube reliant le bécher contenant l’ACSF et la chambre d’enregistrement aussi courte que possible (1 m).
- Sélectionnez une tranche de cerveau dans la chambre de réserve et transférez-la dans la chambre d’enregistrement à l’aide de la plus grande ouverture d’une pipette Pasteur en verre. Couvrez la tranche avec un anneau en platine pour l’ancrer au fond de la chambre d’enregistrement. Utilisez un anneau plat en platine (Ø 1,5 cm) et collez-y des fils de nylon parallèles (espacement >2 mm).
- Ajuster et optimiser l’optique
- Visualisez les tranches à l’aide de la vidéomicroscopie infrarouge (IR). Ajustez l’éclairage Köhler 51 et optimisez l’optique de contraste interférentiel différentiel (DIC) ou l’éclairage oblique (Dodt Gradient contrast - DGC).
- Vérifiez la qualité de la tranche. Ne conservez que des tranches avec des surfaces lisses et uniformes qui ne sont pas trop contrastées et qui n’ont que de petits cratères dispersés.
- Remplissez 2 pipettes patch fraîches et non utilisées avec une solution intracellulaire (tableau 3). À l’aide d’un tube de 0,5 mL contenant la solution de pipette, remplir l’extrémité de la pipette par capillarité. Pour accélérer le remplissage de l’embout des pipettes sans filament, appliquez une pression négative à l’extrémité de la pipette à l’aide d’un tube fixé à une seringue.
- Positionnez les pipettes au-dessus de la surface de la tranche
- Vérifiez la présence d’un revêtement chlorure sur les fils d’argent.
- Insérez les pipettes séquentiellement dans les porte-pipettes et appliquez une pression positive (~70 mbar) à l’aide d’un circuit de tubes reliant le porte-pipette, d’un robinet à trois voies et d’un manomètre. Abaissez la pipette dans le bain de la chambre d’enregistrement.
- Vérifiez que la valeur de pression sur le manomètre est constante pendant ~1 à 2 min. Si la pression diminue, vérifiez le tube ou les joints toriques d’étanchéité à l’intérieur du porte-pipette.
- Placez la pointe de la pipette au milieu de l’écran vidéo et assurez-vous qu’elle n’est pas obstruée. Assurez-vous que la pointe de la pipette ne bouge pas lors de l’application ou du relâchement de la pression sur la pipette.
- Vérifiez la dérive et les vibrations de la pointe de la pipette en traçant une petite croix au centre du moniteur exactement à la position de la pointe de la pipette et observez pendant 5 minutes les mouvements possibles de la pointe.
- Appliquez un pas de tension (5 mV) pour surveiller la résistance de la pipette sur un oscilloscope. Réglez le potentiel de maintien de l’amplificateur patch-clamp sur 0 mV. Annulez le potentiel de décalage de la pipette de sorte que le courant CC de la pipette indique zéro à l’ampèremètre.
- Déplacez les pipettes vers le bas jusqu’à la tranche et maintenez-les au-dessus de la surface.
- Sélectionner et patcher un neurone avec de longues dendrites
- Dans la substance noire, sélectionnez un neurone sain avec de longues dendrites qui peuvent être suivies sur une longue distance à peu près dans le même plan (Figure 1A et 1B) en utilisant le contraste de gradient IR-Dodt (IR-DGC). Choisissez un corps cellulaire lisse et homogène. Evitez les deux cellules fortement contrastées à la surface de la tranche (Figure 1C et 1D), car il est difficile de s’y roder et de conserver des conditions d’enregistrement stables dans le temps (résistance série stable). Sélectionnez les neurones dont le soma se trouve à 10 à 30 μm sous la surface de la tranche.
- Déplacez l’électrode somatique près du soma (à 40 - 50 μm) et l’électrode dendritique près de la dendrite à la même distance. Utilisez un grossissement 2X (changeur quadruple) pour sélectionner et patcher une partie d’une dendrite. Obtenez sur le moniteur un grossissement absolu de 2 100X sans grossissement (1X) et de 5 500X avec un grossissement de 2X.
- Relâchez légèrement la pression de la pipette somatique de 10 mbar. Si nécessaire, réguler la pression des pipettes dendritiques et somatiques pour éviter le déplacement de la structure cellulaire (soma et dendrite) à l’intérieur de la tranche.
- Positionnez la pipette dendritique près de la membrane afin de voir une petite fossette. Relâchez la pression sur la pointe de la pipette et patchez la dendrite tout en contrôlant la résistance de la pipette. Dans des conditions idéales, seule une très légère aspiration suffit pour obtenir une bonne étanchéité.
- Réduire autant que possible l’amplitude des transitoires de capacité de la pipette au-dessus de l’étape de courant à l’aide d’une impulsion de tension à gain élevé et à faible filtrage 51 et de l’oscilloscope. Entrez en mode cellule entière avec la pipette dendritique.