Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Enregistrements électrophysiologiques pour étudier l’activité spontanée et dépendante de la stimulation par électrodes
- Laver la culture multi-électrodes (MEA) avec une solution extracellulaire, à température ambiante (RT).
- Séchez les contacts avec un mouchoir en papier et montez le MEA sur le MEA setup.
note: Pour garder la culture humide pendant le montage, ajoutez une petite goutte de solution extracellulaire à la culture.
- Ajouter 300 μl de solution extracellulaire et attendre 10 min avant l’enregistrement, pour permettre au système de se stabiliser.
- Enregistrez l’activité spontanée pendant 2 min à partir de toutes les électrodes en appuyant sur le bouton d’enregistrement/acquisition du logiciel et identifiez les électrodes d’enregistrement.
- Stimulation par électrode MEA : Sélectionnez l’amplitude/la durée/la forme du stimulus sur le logiciel approprié et appliquez-le à plusieurs électrodes consécutivement. Sélectionnez les électrodes en fonction de celles qui montrent une activité spontanée (comme à l’étape 1.4). Enregistrez à partir de toutes les électrodes restantes.
- Pour exclure un artefact de stimulation, stimulez à partir de la même électrode 10 fois. Si la culture répond au moins 8 fois sur 10, on peut supposer qu’il s’agit d’une réponse positive lors de la stimulation induite par les électrodes.
- Pour identifier le bruit de fond, appliquer de la tétrodotoxine (TTX) sur la culture à une concentration de 1 μM, pour bloquer les canaux sodiques voltage-dépendants et enregistrer pendant 2 min. Utilisez-le pour effectuer la détection des pointes (2.1 et 2.2).
2. Analyse des données
- À l’aide du logiciel approprié, détectez l’activité spontanée de chaque électrode à l’aide d’un détecteur basé sur les écarts-types et un discriminateur ultérieur. L’activité se présente sous la forme de transitoires de tension rapide (<5 ms).
- Choisissez un seuil qui n’entraîne aucune activité lors de l’analyse des échantillons traités au TTX. Adaptez la valeur seuil de chaque expérience pour faire la distinction entre les détections de faux positifs et de faux négatifs.
- À l’aide d’un logiciel approprié, observez l’activité neuronale détectée de chaque électrode sous forme de graphique matriciel selon les procédures standard (voir Figure 1A-C).
- Déterminez et affichez l’activité totale du réseau en additionnant tous les événements détectés dans une fenêtre glissante de 10 ms, décalée par pas de 1 ms.
- Détectez l’activité induite par la stimulation en affichant les données brutes à l’aide d’un logiciel d’analyse approprié. Identifiez manuellement les pics uniques hors ligne. Les pointes simples apparaissent comme des transitoires de tension rapides, se produisant après l’artefact de stimulation (pointe de flèche dans la figure 1E). La figure 1E en montre un exemple.
- En fonction de l’expérience, analysez le nombre d’électrodes répondantes, le seuil nécessaire pour obtenir une réponse, le nombre de potentiels d’action par électrodes et d’autres paramètres d’intérêt.
