Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
REMARQUE : Chaque participant impliqué dans la procédure doit être correctement formé aux procédures chirurgicales de base et doit disposer d’une licence valide pour effectuer des expériences sur des animaux.
1. Anesthésie et prémédication
- Anesthésier un rat avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital sodique (une dose initiale de 60 mg·kg-1 pour des rats Wistar mâles de 6 mois pesant 400\u2012550g).
note: Ce protocole n’est pas limité à la souche, au sexe ou à l’âge indiqués des rats. De plus, des anesthésies alternatives, telles que le mélange kétamine-xylazine, l’alpha-chloralose ou le fentanyl + midazolam + médétomidine, peuvent être utilisées si elles conviennent mieux à différents objectifs de recherche ou lorsque le comité d’éthique l’exige.
- Après environ 5 minutes, vérifiez la profondeur de l'anesthésie en pinçant l'orteil de la patte arrière du rat avec une pince émoussée. Ne passez aux étapes suivantes du protocole que lorsqu’aucun réflexe n’est observé.
- Injecter 0,05 mL d’atropine par voie sous-cutanée afin de réduire la production de mucus après l’intubation.
- Injecter par voie sous-cutanée 5 mL de tampon phosphate contenant une solution de glucose à 4 %, du NaHCO3 (1 %) et de la gélatine (14 %). Ce tampon sera absorbé par les vaisseaux cutanés tout au long d’une expérience et aidera à maintenir l’équilibre hydrique.
- Tout au long de l’opération, vérifiez périodiquement que l’animal n’a pas d’actions réflexes et complétez l’anesthésie si nécessaire (10 mg·kg-1· h-1 de pentobarbital sodique).
2. Chirurgie
- Préparez l’animal au traitement chirurgical en rasant la fourrure sur la partie dorsale de la patte postérieure gauche, de la cheville à la hanche, à l’arrière, de la queue aux segments thoraciques supérieurs (Th), le côté gauche de la poitrine et la face ventrale de la région du cou au-dessus du sternum
- Mise en place de la ligne intraveineuse
- Placez le rat sur son dos sur un coussin chauffant en boucle fermée (et fixez-le avec des fixations de membre).
- À l’aide d’une lame de 21 lames, faites une coupe longitudinale à travers la peau du sternum au menton.
- Tenez la peau avec une pince et séparez-la du tissu sous-jacent.
- À l’aide de techniques de dissection contondante, exposez la veine jugulaire droite. Disséquez soigneusement la veine des tissus environnants.
- Localisez la partie de la veine sans points de ramification et glissez deux ligatures 4-0 en dessous.
- Faites un nœud lâche à l’extrémité proximale du segment non ramifié de la veine précédemment identifié et un nœud lâche à l’extrémité distale de ce segment de la veine. Clampez la veine proximale au cœur, puis ligaturez la partie distale de la veine.
- À l’aide de ciseaux à iris, faites une incision entre la pince et la ligature à distance. Tenez un lambeau de la veine et introduisez un cathéter prérempli jusqu’au point où il est bloqué par la pince.
- Tout en tenant la veine et le cathéter ensemble à l’aide d’une pince, retirez la pince et enfoncez le cathéter sur plusieurs millimètres dans la veine. Fixez les deux extrémités du cathéter à la veine et ajoutez un point de fixation supplémentaire à la peau.
3. Introduction de la sonde trachéale
- À l’aide d’une pince émoussée, séparez les deux glandes mandibulaires recouvrant les muscles sterno-hyoïdes. Séparez les muscles sterno-hyoïdiens sur la ligne médiane pour exposer la trachée.
- Glissez trois ligatures 4-0 sous la trachée, puis faites deux nœuds sous le point d’insertion de la sonde trachéale et un nœud au-dessus.
- Localisez le cartilage cricoïde du larynx et faites une incision sous le troisième cartilage trachéal.
- Insérez un tube trachéal dans la trachée et fixez le tube en place avec des ligatures préparées à l’avance, puis ajoutez une ligature supplémentaire à la peau.
- Placez un petit morceau de coton au-dessus des muscles séparés et suturez la peau sur la zone opérée.
4. Dissection des nerfs des membres postérieurs
- À l’aide d’une lame 21, faites une coupe longitudinale sur la face postérieure du membre postérieur gauche, du tendon d’Achille à la hanche.
- Saisissez la peau avec une pince et, à l’aide de techniques de dissection contondantes, séparez la peau des muscles sous-jacents des deux côtés de l’incision.
- Localisez la fosse poplitée à l’arrière de l’articulation du genou, qui est recouverte par le muscle biceps fémoral, et à l’aide de ciseaux, faites une coupe entre la partie antérieure et postérieure de ce muscle.
- En vous déplaçant vers le haut, coupez deux têtes du biceps fémoral jusqu’à la hanche pour exposer le nerf sciatique. Cautériser au besoin pour éviter les saignements.
- Identifiez les branches surale, tibiale et péronière commune du nerf sciatique.
- À l’aide de ciseaux, séparez le côté de la tête médiale du muscle gastrocnémien pour exposer le nerf tibial et ses branches.
- À l’aide de 55 pinces, saisissez l’extrémité distale du nerf sural, coupez-le distalement et disséquez-le autant que possible.
- Répétez la procédure avec le nerf péronier commun.
- À l’aide d’une tige de verre émoussée, séparez le nerf tibial des tissus environnants, en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins, et coupez-le distalement.
- Identifiez les nerfs gastrocnémien médial (MG) et les nerfs gastrocnémien et soléaire latéraux (LGS).
- À l’aide de 55 pinces, disséquez soigneusement les nerfs MG et LGS, en les déconnectant des tissus environnants mais en maintenant leur connexion aux muscles respectifs.
- Placez un morceau de coton imbibé de sérum physiologique sous les nerfs exposés.
- Fermez la peau sur la zone opérée.
5. Laminectomie
- À l’aide d’une lame 21, faites une incision longitudinale du sacrum jusqu’aux vertèbres thoraciques.
- Séparez la peau des muscles sous-jacents.
- Coupez le muscle longissimus des deux côtés des apophyses épineuses thoracique et lombaire.
- À l’aide d’un scalpel à bord émoussé, rétractez les muscles de la colonne vertébrale pour exposer les processus transverses de chaque vertèbre.
- À l’aide de ciseaux à pointe émoussée, coupez les tendons des muscles reliés aux apophyses transverses le long de la colonne vertébrale exposée. Appliquez des agents hémostatiques si nécessaire.
- Identifiez la vertèbre Th13 comme le segment thoracique le plus bas avec insertion de côtes et, à l’aide de rongeurs fins, retirez les apophyses épineuses et les lames des vertèbres Th13 à L2 pour exposer les segments lombaires de la moelle épinière. N’oubliez pas de ne pas endommager l’apophyse épineuse L3, qui servira de point de fixation pour la stabilisation de la colonne vertébrale.
- Retirez l’apophyse épineuse Th12 et lissez la surface dorsale de la vertèbre autant que possible.
- À l’aide de techniques de dissection émoussée, séparez les muscles de la vertèbre Th11 pour créer des points d’insertion de support.
- Placez un coton mince et imbibé de sérum physiologique sur les segments exposés de la moelle épinière.
- Déplacez le rat vers le cadre métallique sur mesure avec deux barres parallèles et deux bras réglables avec des pinces pour soutenir et stabiliser la colonne vertébrale.
6. Préparation à l’enregistrement et stimulation
- Fixation de la colonne vertébrale et arrangement nerveux
- Placez le rat dans le cadre sur mesure sur un coussin chauffant relié au système de chauffage en boucle fermée pour maintenir la température corporelle de l’animal à 37 ± 1°C.
- Insérez des électrodes d’électrocardiogramme (ECG) sous la peau et connectez-vous à un amplificateur pour la surveillance de la fréquence cardiaque.
- À l’aide des lambeaux cutanés, formez une flaque profonde sur la moelle épinière exposée.
- À l’aide de pinces métalliques, fixez la colonne vertébrale en plaçant des pinces sous les apophyses transverses Th12 et au niveau de l’apophyse épineuse L3.
- Assurez-vous que la colonne vertébrale est sécurisée et disposée horizontalement, puis appliquez une pression dorso-ventrale des deux côtés de la colonne pour rétracter les muscles.
- Remplissez la piscine d’huile minérale chaude (37 °C) et maintenez-la à cette température.
- Enfilez une ligature 4-0 à travers le tendon d’Achille, soulevez et étirez le membre postérieur gauche opéré de manière à ce que la cheville soit au niveau de la hanche.
- À l’aide des lambeaux cutanés, faites une flaque profonde sur les nerfs tibiaux, MG et LGS exposés.
- Remplissez la piscine d’huile minérale chaude (37 °C).
- Placez les nerfs MG et LGS sur des électrodes de stimulation bipolaires en fil d’argent et connectez-les à un stimulateur d’impulsions carrées. Utilisez des canaux de stimulation distincts pour chaque nerf.
7. Placement des électrodes de surface
- Placez une électrode à bille argentée sur le côté caudal gauche de la moelle épinière exposée, avec une électrode de référence insérée dans les muscles du dos, et connectez les deux électrodes à l’amplificateur différentiel CC. L’électrode à bille de surface sera utilisée pour enregistrer les volées afférentes des nerfs.
- À l’aide d’un stimulateur à courant constant, stimulez les nerfs MG et LGS avec des impulsions carrées d’une durée de 0,1 ms, répétées à une fréquence de 3 Hz, et observez les volées afférentes.
- Déterminez le seuil (T) d’activation nerveuse, stimulez chaque nerf à une intensité d’environ 3·T et notez l’amplitude de la volée afférente pour chaque nerf.
- Déplacez l’électrode de surface vers le rostral et répétez la procédure pour identifier les segments de la colonne vertébrale où les amplitudes des volées sont les plus élevées pour chaque nerf. Après avoir déterminé l’emplacement maximal de la volée, déplacez l’électrode de surface à une distance de sécurité de la moelle épinière.
- Paralysie musculaire et formation d’un pneumothorax afin de réduire les mouvements respiratoires
- Paralysez le rat par voie intraveineuse à l’aide d’un bloqueur neuromusculaire et connectez le tube trachéal à un ventilateur externe en ligne avec un capnomètre compatible avec les rongeurs (bromure de pancuronium, à une dose initiale de 0,4 mg·kg-1, complété toutes les 30 minutes à des doses de 0,2 mg·kg-1)
- Surveillez la concentration de CO2 en fin d’expiration et maintenez-la à environ 3 à 4 % en ajustant les paramètres de ventilation (fréquence, pression atmosphérique et débits).
- Faites une incision longitudinale dans la peau entre la 5e et la 6e côte sur le côté de l’enregistrement.
- À l’aide de ciseaux à bout émoussé, coupez les muscles sus-jacents pour visualiser l’espace intercostal entre les côtes.
- À l’aide de petits ciseaux tranchants, faites une petite incision dans les muscles intercostaux et dans la plèvre, puis insérez la pointe d’une pince à bord émoussé dans l’ouverture, en prenant soin de ne pas appuyer sur les poumons.
- Laissez les pinces se dilater ou insérez un petit tube pour garder le pneumothorax ouvert tout au long de l’expérience.
- Après le bloc neuromusculaire, surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la fréquence de l’ECG et complétez l’agent anesthésique si la fréquence cardiaque dépasse 400 bpm. Paralysie musculaire et formation d’un pneumothorax pour réduire les mouvements respiratoires, ce qui améliorera la stabilité de l’enregistrement.
8. Ouverture de la dure-mère et de la pie-mère
- À l’aide d’une pince #55, soulevez doucement la dure-mère et coupez-la caudalement du segment L5, rostralement jusqu’au segment L4.
- À l’aide d’une paire de pinces ultra-minces 5SF, faites une petite tache dans la pia couvrant la colonne dorsale entre les vaisseaux sanguins, exactement au niveau de la volée afférente maximale du nerf MG ou LGS.
- Utilisez de petits morceaux de mousse de gel imbibée de sérum physiologique et séchée pour bloquer les saignements si nécessaire.
9. Placement des électrodes de stimulation transspinale à courant continu (tsDCS)
- Faites une petite incision dans la peau de la face ventrale de l'abdomen d'un rat au niveau rostrocaudal, correspondant à l'emplacement des segments lombaires (L)4-L5 de la colonne vertébrale
.
- Saisissez le rabat de peau exposé à l’aide d’une pince métallique, qui servira d’électrode de référence.
- Placez une éponge imbibée de solution saline sur la face dorsale de la vertèbre thoracique (Th) 12. Assurez-vous que la taille de l’éponge est égale à celle d’une électrode tsDCS active (plaque en acier inoxydable en forme de cercle de 5 mm de diamètre).
- À l’aide d’un manipulateur fin, appuyez l’éponge avec une électrode tsDCS active sur l’os et assurez-vous que toute la surface de l’électrode est pressée de manière égale.
- Connectez les électrodes tsDCS de référence et actives à une unité de stimulation à courant constant capable de fournir un flux continu de courant continu.
10. Préparation des micropipettes
- À l’aide d’un extracteur de microélectrodes, préparez une microélectrode.
note: Des électrodes à filament et non filament peuvent être utilisées. Cependant, n’oubliez pas que la tige de l’électrode doit être suffisamment longue pour atteindre la corne ventrale tout en étant suffisamment fine pour ne pas comprimer la moelle épinière lors de la descente.
- Ajustez le réglage de l’extracteur de sorte que la tige entrant dans la moelle épinière mesure environ 3 mm de long, que la pointe de l’électrode ne dépasse pas 1 à 20 m de diamètre et que la résistance de la microélectrode soit comprise entre 10 et 20 MΩ.
- Remplissez les microélectrodes avec de l’électrolyte de citrate de potassium 2M.
- Montez la microélectrode préparée sur le micromanipulateur, permettant un mouvement de pas de 1 à 2 μm et un étalonnage stéréotaxique.
- Connectez la microélectrode à l’amplificateur intracellulaire avec l’électrode de référence placée dans les muscles du dos.
- Après le bloc neuromusculaire, surveillez la profondeur de l’anesthésie en vérifiant la fréquence de l’électrocardiogramme (ECG) et complétez l’agent anesthésique afin que la fréquence cardiaque du rat ne dépasse pas 400 bpm.
11. Suivi et pénétration des motoneurones
- Replacez l’électrode d’enregistrement de la volée afférente sur la surface dorsale de la moelle épinière, caudalement à l’emplacement du site d’enregistrement, au niveau du segment L6.
- Stimulez les nerfs gastrocnémien médial (MG) et les nerfs gastrocnémien et soléaire latéraux (LGS) avec des impulsions électriques de 0,1 ms à une fréquence de 3 Hz et une intensité de 3T pour activer tous les axones des alpha-motoneurones au sein d’un nerf sélectionné.
- Enfoncez la micropipette dans une zone sélectionnée de la pia avec un angle médiolatéral de 15 à 20° (avec une pointe dirigée latéralement).
- Après être descendu sous la surface, calibrez la microélectrode et compensez sa capacité et son décalage de tension, et continuez la pénétration de la moelle épinière lorsque tous les paramètres sont stables. Un potentiel de champ antidromique du pool de motoneurones sera visible au niveau de la trace de tension des microélectrodes à l’approche d’un noyau moteur dédié lors de la stimulation du nerf respectif.
- Procédez à la pénétration avec la microélectrode par pas de 1 à 2 μm et utilisez périodiquement la fonction de bourdonnement de l’amplificateur intracellulaire pour dégager la pointe de l’électrode de tout résidu.
- Observez la pénétration des motoneurones, qui sera caractérisée par une hyperpolarisation soudaine de la trace de tension enregistrée et l’apparition d’un potentiel de pointe antidromique.
12. Enregistrement de la membrane des motoneurones et propriétés de décharge
- Dans un mode pont de l’amplificateur intracellulaire, identifiez le motoneurone en fonction de l’apparence « tout ou rien » du potentiel d’action antidromique en stimulant les branches nerveuses respectives. Enregistrez 20 traces ultérieures pour un calcul de la moyenne ultérieur.
- Mettre en place un critère d’inclusion strict pour garantir des données de haute qualité : potentiel de membrane au repos d’au moins -50 mV d’amplitude ; amplitudes de potentiel d’action supérieures à 50 mV, avec un dépassement positif ; potentiel de membrane stable pendant au moins 5 min avant l’enregistrement.
- Dans un mode de pince de courant discontinu (mode de commutation de courant 4-8 kHz) de l’amplificateur intracellulaire, évoquer un potentiel d’action orthodromique dans un motoneurone à l’aide d’impulsions de courant de dépolarisation intracellulaires de 0,5 ms. Répétez l’opération au moins 20 fois pour calculer la moyenne hors ligne.
- Stimulez un motoneurone avec 40 impulsions courtes (100 ms) de courant hyperpolarisant (1 nA) afin de calculer la résistance d’entrée de la cellule.
- Stimulez un motoneurone avec des impulsions d’ondes carrées de 50 ms à des amplitudes croissantes pour déterminer la valeur de la rhéobase comme l’amplitude minimale de courant dépolarisant nécessaire pour provoquer un seul pic.
- Injectez des impulsions d’ondes carrées de 500 ms de courant dépolarisant, à des amplitudes croissantes par pas de 0,1 à 2 nA pour évoquer des décharges rythmiques de motoneurones.
13. Stimulation transspinale à courant continu (tsDCS)
- Tout en maintenant une pénétration stable du motoneurone, démarrez la procédure de polarisation par l’application transspinale de courant continu. Ajustez l’intensité du courant et le temps d’application au plan d’expérience (par exemple, 0,1 mA pendant 15 min).
- Immédiatement après avoir allumé le courant continu, observez le potentiel de la membrane du motoneurone. La polarisation anodale (l’électrode active en tant qu’anode) devrait entraîner une dépolarisation du potentiel de membrane, tandis que la polarisation cathodale (l’électrode active en tant que cathode) devrait provoquer un effet opposé. Observez si une variation du potentiel de la membrane au repos en réponse à la stimulation CC est constante, ce qui garantit que l’intensité du champ électrique n’est pas affectée.
- Lors d’une application en courant continu, répétez les étapes 5.3 à 5.6 à intervalles de 5 minutes.
- Éteignez le contrôleur de fréquence et répétez les étapes 5.3 à 5.6 toutes les 5 minutes jusqu’à ce que les enregistrements deviennent instables ou que les critères d’inclusion soient compromis.
- Mettre fin à l’expérience et euthanasier l’animal en lui administrant par voie intraveineuse une dose létale de pentobarbital sodique (180 mg·kg-1).
