Application de courants de bruit aux neurones du noyau vestibulaire médial à l’aide de la technique du patch-clamp à cellules entières

Résumé

Source : Stefani, S. P., et al. Application du bruit stochastique pour l’évaluation de la sensibilité neuronale du noyau vestibulaire médial in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente un protocole impliquant l’application de courants de bruit inférieurs au seuil aux neurones du noyau vestibulaire médial en utilisant la technique du patch-clamp de cellules entières pour étudier l’impact des courants de bruit sur la sensibilité neuronale aux stimuli électriques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Animaux

NOTE : Les souris ont été obtenues auprès de l’Australian Rodent Centre (ARC ; Perth, Australie) et a eu lieu à la Medical Foundation Building Animal Facility de l’Université de Sydney.

1. Maintenez les souris sur un cycle standard de 12 h lumière/obscurité avec enrichissement de l’environnement.
2. Utilisez des souris C57BL/6 mâles et femelles (âgées de 3 à 5 semaines) pour toutes les expériences.

2. Préparation des solutions

1. Préparez 1 L de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) composé de 29 mM de NaHCO₃, 11 mM de glucose, 120 mM de NaCl, 3,3 mM de KCl, 1,4 mM de NaH₂PO₄, 2,2 mM de MgCl₂, 2,77 mM de CaCl₂.
2. Préparez 200 mL de saccharose-ACSF (sACSF) contenant 29 mM de NaHCO₃, 11 mM de glucose, 241,5 mM de saccharose, 3,3 mM de KCl, 1,4 mM de NaH₂PO₄, 2,2 mM de MgCl₂, 2,77 mM de CaCl₂. Avant d’ajouter du CaCl₂ à l’ACSF et au sACSF, gazer les solutions avec du carbogène (95 % O₂ et 5 % CO₂) pour établir un pH de 7,4 et éviter la précipitation du calcium (turabilité).
3. Préparer une solution intracellulaire à base de K⁺ composée de 70 mM de gluconate de potassium, 70 mM de KCl, 2 mM de NaCl, 10 mM d’HEPES, 4 mM d’EGTA, 4 mM de_{Mg 2-ATP}, 0,3 mM de Na 3-GTP, avec un pH final de 7,3 (ajusté à l’aide de KOH).
   note: Il est recommandé de filtrer les solutions intracellulaires à l’aide de filtres de 0,22 μm et de les stocker dans des aliquotes de 0,5 mL à -20 °C.

3. Préparation du tronc cérébral

1. Avant l’extraction du tronc cérébral, équilibrez le sACSF avec du carbogène et laissez-le refroidir à -80 °C pendant 25 min pour former une boue de glace.
2. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (3–5 %) saturé en oxygène (3 mL/min). Une fois que les réflexes de la patte arrière sont absents, décapitez la souris avec des ciseaux en acier inoxydable tranchants.
3. Exposez le crâne en faisant une incision sagittale dans la peau à l’aide d’une lame de rasoir (#22 arrondie).
4. À l’aide de l’extrémité pointue d’une paire de ciseaux à motif standard, faites une petite incision au niveau du lambda et coupez le long de la fissure longitudinale.
5. Réfléchissez soigneusement les os pariétals et occipitaux appariés à l’aide d’une paire de rongeurs Pearson à faible courbure.
   note: Le cerveau est baigné en continu in situ à l’aide de la boue glacée sACSF préalablement préparée au cours de cette procédure.
6. Isolez le tronc cérébral du cerveau antérieur et de son enveloppe osseuse à l’aide d’une lame de rasoir (#11 droite) pour couper le sillon pariéto-occipital et la moelle caudale.
7. Montez l’extrémité ventrale isolée du tronc cérébral sur un bloc de polystyrène trapézoïdal préalablement coupé. À l’aide d’une mèche de papier de soie, enlever l’excès de liquide autour du tissu disséqué et assurer une bonne adhérence du tissu à l’étape de coupe.
   note: Le bloc de polystyrène est coupé en forme trapézoïdale pour garantir que l’extrémité rostrale du mésencéphale s’adapte et se rétrécit dans la moelle épinière.
8. Utilisez de la colle cyanoacrylate pour fixer le bloc de polystyrène avec l’extrémité rostrale du tronc cérébral attachée jusqu’à l’étape de coupe.
9. En utilisant une vitesse d’avance de 0,16 mm/s et une amplitude de vibration de 3,00 mm, préparer des coupes transversales de 200 μm du MVN.
   note: L’emplacement du MVN est déterminé à l’aide de l’atlas du cerveau de souris Paxinos et Franklin. Le MVN (répertorié comme MVe dans l’atlas) se trouve immédiatement ventrolatéral au 4e ventricule et est le plus grand juste avant l’attache du cervelet (entre les collicules inférieurs et l’obex).
10. À l’aide d’une pipette en plastique, transférez les tranches sur un disque de papier filtre placé dans de l’ACSF carbogéné à 25 °C pendant au moins 30 minutes avant l’enregistrement.

4. Instruments

1. Utilisez une configuration électrophysiologique standard pour effectuer la technique de patch clamp à cellules entières.
2. Préparez les micropipettes à l’aide d’un protocole en deux étapes (étape de chaleur 1 : 70 ; étape de chaleur 2 : 45) sur un extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux).
3. Lorsqu’elles sont placées dans le bain, les micropipettes doivent avoir une résistance finale allant de 3 à 5 MΩ avec une solution interne.
   note: Les paramètres utilisés peuvent varier en fonction de la température dans la pièce et peuvent changer assez fréquemment.

5. Électrophysiologie du patch clamp à cellules entières

1. Pour obtenir des enregistrements de patch-clamps de cellules entières à partir de neurones individuels dans le MVN, une solution interne basée sur K+ est utilisée dans la pipette d’enregistrement.
2. Transférez une seule tranche de tissu de la chambre d’incubation à la chambre d’enregistrement et fixez-la à l’aide de fil de nylon sur un poids en forme de U. Perfuser en continu la chambre d’enregistrement avec du carbogéné-ACSF à 25 °C à un débit de 3 mL/min.
3. Après avoir rempli une micropipette avec la solution interne, localisez le MVN à l’aide d’une lentille d’objectif de faible puissance (10x). À l’aide d’un objectif de haute puissance (40x), il est possible de localiser des neurones individuels au sein du MVN.
   note: La qualité de la cellule est essentielle pour garantir la qualité des enregistrements et la durabilité de la cellule lors de la tentative de configuration de la cellule entière. Une cellule appropriée présentera une forme sphérique, une membrane cellulaire réfléchissante et un noyau invisible. Une cellule inadaptée aura un gros noyau visible (en forme d’œuf) et une apparence gonflée/rétrécie.
4. Avant de percer le tissu avec la pipette, appliquez une petite quantité de pression positive pour éloigner les débris de la pointe de la pipette.
5. Déplacez la pipette à l’aide du micromanipulateur vers le neurone choisi, et une petite fossette doit se former sur la membrane neuronale.
   Relâchez la pression positive et appliquez une petite quantité de pression négative.
6. Une fois qu’une étanchéité de 1 GΩ est obtenue, appliquez une pression négative douce, courte et nette sur le support de la pipette à travers l’orifice d’aspiration pour rompre la membrane et créer une configuration de cellules entières.
7. Effectuez des enregistrements de pinces ampèremétriques sur l’ensemble de la cellule à l’aide de techniques standard.

6. Application du bruit sinusoïdal et stochastique à des neurones du noyau vestibulaire médial

1. Appliquez le bruit stochastique et sinusoïdal à une gamme d’amplitudes de 3 à 24 pA pour déterminer le seuil neuronal et la vitesse de décharge.
2. Déterminez le seuil sensoriel en regroupant les intensités de stimulus inférieures et supérieures et effectuez une ANOVA pour observer les différences (comme le montre la figure 1).
3. Calculer le taux de décharge moyen sur la période de 10 s où le pas de courant de dépolarisation a été/sera injecté pour chaque niveau de courant individuel (c.-à-d. 7 épisodes au total ; Figure 2).
4. Utilisez les valeurs de vitesse de tir moyenne pour générer une vitesse de tir par rapport au graphique actuel et effectuez une analyse de régression linéaire pour déterminer le gradient de la ligne de meilleur ajustement. Le gradient de la ligne la mieux ajustée indique le gain neuronal.

Résultats

Figure 1 : Détermination objective du seuil de 12 pA. Les taux de décharge pour moins de 12 pA (3 et 6 pA) et plus de 12 pA (18 et 24 pA) ont été regroupés et moyennés. Ces moyennes ont ensuite été analysées à l’aide d’une ANOVA et d’une signification statistique entre le placebo et >12 pA et entre <12 pA et >12 pA. *p < 0,05.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CaCl2	Scharlau	CA01951000	Utilisé pour ACSF et sACSF
D-(+)-glucose	sigma	Référence G8270	Utilisé pour ACSF et sACSF
EGTA	sigma	E0396-25G	Utilisé pour une solution intracellulaire à base de K
HEPES	sigma	H3375-25G	Utilisé pour une solution intracellulaire à base de K
Kcl	Approvisionnement en produits chimiques	PA054-500G	Utilisé pour l’ACSF, le sACSF et les solutions intracellulaires
K-gluconate	sigma	Réf. P1847-100G	Utilisé pour une solution intracellulaire à base de K
Mg-ATP	sigma	A9187-500MG	Utilisé pour une solution intracellulaire à base de K
MgCl	Approvisionnement en produits chimiques	MA00360500	Utilisé pour ACSF et sACSF
Na3-GTP	sigma	Référence G8877-100MG	Utilisé pour une solution intracellulaire à base de K
NaCl	Approvisionnement en produits chimiques	SO02270500	Utilisation pour ACSF et solution intracellulaire
NaH2PO4.2H 2O	Ajax	AJA471-500G	Utilisé pour ACSF et sACSF
NaHCO3	sigma	S5761-1KG	Utilisé pour ACSF et sACSF
saccharose	Approvisionnement en produits chimiques	SA030-500G	Utilisé pour sACSF
L’isoflurane	Henry Schein	1169567762	Utilisé pour l’anesthésie des souris
équipement
Capillaires en verre borosilicaté	Instruments Warner	GC150T-7.5	1,5 mm de diamètre extérieur, 1,16 mm de diamètre intérieur, 7,5 cm longueur
Logiciel d’acquisition de données	Axographe		Utilisé pour l’électrophysiologie et l’analyse
Friedmen-Pearson Rongeurs	Instruments de précision mondiaux	Référence 14089	Utilisé pour la dissection
Extracteur de micropipette	Narishige	PP-830	Utilisé pour les micropipettes
Amplificateur Multiclamp	Instruments Axon	700 milliards	Utilisé pour l’électrophysiologie
Ph-mètre	Sper scientifique	860033	Utilisé pour la solution interne
Ciseaux à motif standard	Le	Référence 14028-10	Utilisé pour la dissection
Micromanipulateur Sutter	Sutter	MP-225/M	Utilisé pour l’électrophysiologie
Microscope droit	Olympe	BX51WI	Utilisé pour l’électrophysiologie
Vibratome	Leica	VT1200	Utilisé pour trancher le tissu cérébral