Détection des niveaux de peroxyde d’hydrogène dans des neurones en culture grâce à l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes

Résumé

Source : Terzi, A. et al., ROS Imagerie des cellules vivantes au cours du développement neuronal.J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une technique permettant de détecter en temps réel les niveaux de peroxyde d’hydrogène dans les cellules ganglionnaires de la rétine à l’aide du biocapteur roGFP2-Orp1 et des techniques d’imagerie de cellules vivantes. Il décrit les étapes de la préparation des cellules, de l’imagerie par fluorescence et de la quantification des niveaux de peroxyde d’hydrogène.

Protocole

1. Imagerie in vitro des neurones de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) en culture

1. Le jour de l’imagerie (généralement 6 à 24 heures après le placage cellulaire), vérifiez les cellules ganglionnaires rétiniennes au microscope pour valider la croissance des axones RGC.
2. Pour l’imagerie de cellules vivantes, transférez les lamelles de la boîte de culture vers une chambre d’imagerie de cellules vivantes.
3. Configurer le microscope pour l’imagerie. Utilisez un microscope inversé équipé d’un objectif à contraste interférentiel différentiel (DIC), d’un filtre rouge passe-long OG590 et d’une caméra EM-CCD.
4. Avant l’imagerie, remplacez le milieu de culture cellulaire de poisson-zèbre par du sérum et des antibiotiques (ZFCM)(+)) par un milieu de culture cellulaire de poisson-zèbre sans sérum ni antibiotiques (ZFCM(-)).
5. Une fois que les cellules sont positionnées avec un objectif 10x, acquérez des images à un grossissement de 60x à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique. Utilisez un grossissement supplémentaire de 1,5x.
6. Tout d’abord, acquérez des images DIC. Ensuite, imagez roGFP2-Orp1 à l’aide d’un jeu de filtres approprié. Excitez roGFP2-Orp1 avec des filtres d’excitation 405/20 et 480/30 nm de manière séquentielle et acquérez des images avec un filtre d’émission 535/30 nm après que la lumière d’émission a passé le miroir dichroïque 505DCXR.
7. Après avoir pris la première série d’images, échangez les supports avec des supports contenant différentes solutions de traitement. Le milieu doit être changé toutes les 30 minutes d’imagerie pour éviter les changements de pH et d’osmolarité.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de culture de 35 mm	Sarstedt	Référence 83-3900
Verre de protection	Corning	Référence 2850-22
Boîtes de Pétri jetables (100 x 15 mm)	VWR	Référence 25384-094
Sérum fœtal bovin	ThermoFisher Scientific	26140087
Microscope inversé	Nikon	TE2000
Laminine	ThermoFisher Scientific	Référence 23017-015
Le L-15 Medium de Leibovitz avec rouge de phénol	Gibco/Fisher Scientific	Tél. : 11-415-064
Milieu L-15 de Leibovitz sans rouge de phénol	Gibco/Fisher Scientific	Référence 21-083-027
Pénicilline/streptomycine	ThermoFisher Scientific	15140122
Rouge phénol	Sigma Aldich	Réf. P0290
Poly-D-lysine (PDL)	Sigma Aldich	P7280
Filtre Steritop 0,22 μm	Millipore	S2GPT05RE
Chlorure de calcium dihydraté	Fisher Scientific	Réf. C79-500
glucose	Sigma Aldrich	G7528
HEPES	Sigma Aldrich	N° H4034