Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique approprié des animaux.
1. Préparation préliminaire (facultatif : préparez 1 jour à l’avance)
- Préparez trois types de solution de liquide céphalorachidien artificiel (solution normale, solution de saccharose et solution de récupération, 1 L chacune ; voir le tableau 1). Ajustez l’osmolalité des solutions à 300 ± 10 mOsm et refroidissez l’ACSF-Sacrose jusqu’à un point proche du point de congélation (0-4 °C).
note: L’utilisation d’une solution de coupe à faible teneur en sodium (ACSF-Saccharose) permet de préserver la viabilité des neurones dans les couches superficielles des tranches aiguës.
- Préparez 0,75 mL de solution disparatique contenant un fluorophore rouge (p. ex., Alexa-594) et un indicateur de calcium synthétique vert (p. ex., Oregon Green BAPTA-1 ; voir le tableau 1). Inclure la biocytine (voir tableau 1) dans la solution de patch si une identification morphologique a posteriori des cellules enregistrées est nécessaire.
- Ajustez l’osmolalité de la solution à 280 ± 5 mOsm et le pH à 7,35 ± 0,5. Conservez la solution au réfrigérateur ou sur de la glace en tout temps.
note: Le choix de l’indicateur calcique doit être fondé sur sa plage dynamique et sur la nature des événements Ca2+ étudiés.
- À l’aide d’un extracteur de micropipettes, préparer des pipettes patch à partir de capillaires en verre borosilicaté (voir Tableau des matériaux) avec une pointe ≈ de 2 μm (résistance de la pipette de 3 à 5 MΩ) et des pipettes de stimulation à partir de capillaires en verre thêta borosilicaté (voir Tableau des matériaux) avec une pointe de 2 à 5 μm.
note: Les réglages de l’extracteur pour fabriquer des pipettes d’un diamètre et d’une forme donnés seront déterminés par le type de filament de l’extracteur et les résultats du test de rampe pour un type de verre donné.
2. Enregistrements Patch-clamp à cellules entières
- Placez une tranche d’hippocampe en place dans un bain positionné sous l’objectif (grossissement : 40x, ouverture numérique : 0,8) d’un microscope à deux photons à balayage laser. Perfuser continuellement le bain avec de l’ACSF-Normal oxygéné chauffé à 30-32 °C à un débit de 2,5-3 mL/min.
- Utilisez la microscopie infrarouge à contraste interférentiel différentiel (IR-DIC) ou la microscopie Dodt-SGC pour localiser une cellule d’intérêt à l’aide de sa taille, de sa forme et de sa position.
note: En fonction de la population de neurones ciblée, un modèle de souris transgénique peut être utilisé pour localiser facilement les cellules d’intérêt. Dans ce cas, cette étape peut être remplacée par l’utilisation d’une source de lumière fluorescente.
- Remplissez une pipette de stimulation avec une solution ACSF-Normal contenant le fluorophore rouge (par exemple, Alexa-594).
- Placez la pipette de stimulation (reliée à une unité de stimulation électrique) sur le dessus de la tranche de manière à ce que la pointe se trouve dans la même région que la cellule d’intérêt.
- Après avoir rempli la pipette patch avec la solution de patch et l’avoir fixée à un étage de tête, placez-la sur la tranche de sorte que sa pointe soit directement au-dessus de la cellule d’intérêt.
- Insérez une seringue dans un robinet d’arrêt à trois voies et connectez-la à la pipette patch à travers le tube en plastique. Injectez une pression positive constante dans la pipette patch (≈ 0,1 mL) à l’aide de la seringue. Maintenez le robinet d’arrêt en position « proche ».
- Activez le module logiciel de contrôle de l’amplificateur et passez en mode pince de tension en cliquant sur le bouton « VC ». Ouvrez le logiciel d’acquisition de données électrophysiologiques (par exemple, clampex) pour l’acquisition de signaux électrophysiologiques et cliquez sur l’icône « Test de membrane » pour qu’il envoie en permanence une impulsion de tension carrée (5 mV, 10 ms), qui est nécessaire pour surveiller les changements de résistance de la pipette.
- Abaissez la pipette patch jusqu’à ce qu’elle se trouve juste au-dessus de la cellule ciblée. En entrant en contact avec la membrane cellulaire, retirez la pression en tournant le robinet d’arrêt en position « ouverte ».
note: Le contact avec la membrane cellulaire est détecté lorsqu’une légère augmentation de la résistance de la pipette (≈ 0,2 MΩ) est observée, et une petite indentation sur la cellule est causée par une pression positive.
- Appliquez une légère pression négative sur la pipette patch à l’aide d’une seringue vide insérée dans le robinet d’arrêt jusqu’à ce que la résistance de la pipette fournie par le logiciel atteigne 1 GΩ. Dans la fenêtre « Test membranaire » du logiciel d'acquisition de données, clampez la cellule à -60 mV.
- Continuez à appliquer une pression négative jusqu’à ce que la cellule soit ouverte et que la configuration de la cellule entière soit obtenue. La détection de cet état cellulaire est basée sur la variation soudaine de la résistance de la pipette (de 1 GΩ à 70-500 MΩ selon le type d'interneurone) et l'apparition de grands transitoires capacitifs dans la fenêtre de « test membranaire ».
3. Calcium à deux photons (Ca2+)Imagerie
- Si vous vous intéressez aux réponses postsynaptiques excitatrices, ajoutez la gabazine (10 μM), un antagoniste des récepteurs GABAA, et un bloqueur des récepteurs GABAB CGP55845 (2 μM) au bain ACSF.
- Dans le module logiciel de contrôle de l'amplificateur, réglez la configuration du patch sur current-clamp en cliquant sur le bouton « CC » et enregistrez le modèle de décharge de la cellule en réponse aux injections somatiques de courant dépolarisant (0,8-1,0 nA, 1 s). Attendez au moins 30 min que la cellule soit remplie avec les indicateurs présents dans le patch solution.
note: Le modèle de décharge et les propriétés actives de la cellule peuvent être utilisés pour identifier son sous-type, par exemple, les cellules à pic rapide. Il est important que la concentration de l’indicateur se stabilise par diffusion avant de commencer à enregistrer les transitoires calciques (CaT) (voir le Tableau 2 pour le dépannage).
- CaTs évoqués AP
- À l’aide du logiciel d’acquisition d’images, commencez à acquérir des images. Localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence rouge. Pour assurer une réponse visible, choisissez d’abord une dendrite proximale (≤ 50 μm) car l’efficacité de la rétropropagation des points d’accès peut diminuer considérablement avec la distance dans les interneurones GABAergiques.
- À l'aide de l'outil rectangulaire du logiciel d'acquisition d'images, zoomez sur la région ciblée et passez en mode « xt » (balayage linéaire). Positionnez le balayage sur la branche dendritique d’intérêt. Avec les contrôleurs d’intensité laser dans le logiciel d’acquisition, réglez le laser à deux photons à un niveau de puissance minimal où la fluorescence verte de base est à peine visible pour éviter la phototoxicité.
- Dans le logiciel d'acquisition de données d'électrophysiologie 'Protocol' logiciel d'acquisition de fenêtres et d'images, créez un essai d'enregistrement de la durée souhaitée contenant une injection de courant somatique de l'amplitude souhaitée.
- À l’aide du logiciel d’acquisition d’images, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » et acquérez la fluorescence en continu pendant 1 à 2 s. Répétez l’acquisition d’images 3 à 10 fois. Attendez au moins 30 s entre les balayages simples pour éviter les dommages causés par le photo. Si vous acquérez des linéaires à plusieurs points le long d’une dendrite, prenez-les dans un ordre aléatoire pour éviter les effets d’ordre.
- CaTs évoqués synaptiquement
- Localisez une dendrite d’intérêt à l’aide du signal de fluorescence rouge.
- Placez la pipette de stimulation sur la surface de la tranche au-dessus de la dendrite d’intérêt. Abaissez lentement la pipette de stimulation en place, en minimisant les mouvements pour éviter de perturber la configuration de l’ensemble de la cellule. Positionnez la pipette à 10-15 μm de la dendrite.
- Pour visualiser l'emplacement des microdomaines synaptiques dans les dendrites aspiny, dans le logiciel d'acquisition d'images, passez en mode 'xt' (balayage linéaire) et positionnez la ligne le long de la branche dendritique d'intérêt.
- Dans la fenêtre « Protocole » (du logiciel d'acquisition de données d'électrophysiologie) et le logiciel d'acquisition d'images, créez un essai d'enregistrement qui déclenche l'unité de stimulation après le début de l'essai.
- À l’aide du logiciel d’acquisition, cliquez sur le bouton « Démarrer l’enregistrement » pour numériser le long de la dendrite en continu pendant 1 à 2 s. Répétez l’acquisition 3 à 5 fois, en attendant 30 s entre les numérisations pour éviter les dommages photologiques.
note: La durée du balayage peut être ajustée en fonction de la cinétique de l'événement évoqué, mais doit être minimisée pour éviter les photodommages (voir le tableau 2 pour le dépannage).
- Répétez l’étape 3.4.5 dans différentes conditions (p. ex., intensité ou durée de stimulation différentes, introduction d’un bloqueur pharmacologique, etc.) en fonction de la question spécifique abordée.
- Arrêter l’acquisition lorsque la cellule montre des signes de détérioration de l’état de santé : dépolarisation inférieure à -45 mV, augmentation du taux de base en Ca2+, détérioration morphologique des dendrites (par exemple, bourdonnements, fragmentation ; voir le tableau 2 pour le dépannage).
- Pour obtenir des informations préliminaires sur la morphologie de la cellule et garder une trace de l'emplacement de la pipette de stimulation, acquérez une pile Z de la cellule dans le canal rouge. À l'aide du logiciel d'acquisition en mode « xyz », définissez les limites supérieure et inférieure de la pile pour imager l'ensemble de la cellule avec tous les processus inclus. Réglez la « taille du pas » à 1 μm et lancez l'acquisition de la pile à l'aide du bouton « Démarrer l'enregistrement ».
- Lorsque l’acquisition de la pile Z est terminée, utilisez l’option « Projection maximale » du logiciel pour superposer tous les plans focaux de la pile et vérifier la qualité de l’acquisition. Ensuite, rétractez lentement la pipette patch hors de la tranche.
- Pour fixer la tranche en vue d’une identification morphologique a posteriori, retirez rapidement la tranche du bain à l’aide d’un pinceau plat et placez-la entre deux papiers filtres dans une boîte de Pétri remplie d’ACSF. Remplacez l’ACSF par une solution de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et laissez le plat dans une pièce à 4 °C ou au réfrigérateur pendant la nuit.
Tableau 1 : Recettes de solutions. Composés et concentrations des solutions utilisées pendant le protocole.
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| solution | composant | Concentration (mM) |
| ACSF-Normal | NaCl | 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| Magnésium (MgSO4 | deux |
| NaHCO3 | 26 |
| glucose | 10 |
| CaCl2 | deux |
| ACSF-Recovery | NaCl | 124 |
| Kcl | 2.5 |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| Magnésium (MgSO4 | 3 |
| NaHCO3 | 26 |
| glucose | 10 |
| CaCl2 | 1 |
| ACSF-Saccharose | Kcl | deux |
| NaH2PO4 | 1,25 |
| Magnésium (MgSO4 | 7 |
| NaHCO3 | 26 |
| glucose | 10 |
| saccharose | 219 |
| CaCl2 | 1 |
| K+ - solution de correctif | K+-gluconate | 130 |
| HEPES | 10 |
| MgCl2 | deux |
| Phosphocréatine di(tris)sel | 10 |
| ATP-Tris | deux |
| GTP-Tris | 0,2 |
| Biocytine | 72 |
| Alexa-594 | 0,02 |
| Vert Oregon-BAPTA-1 | 0,2 |
Table 2 : Table de dépannage. Solutions aux problèmes courants qui peuvent survenir lors d’une expérience d’imagerie Ca2+.
| problème | solution |
| Impossible de réparer un neurone sain | Vérifiez si les tranches ne sont pas en bonne santé : cellules rétrécies ou enflées, noyaux visibles, etc. Si c’est le cas, jetez les tranches. Vérifiez également la résistance du patch-pipette et l'osmolalité de la solution patch ; Remplacez-les si les valeurs ne sont pas dans la plage appropriée. |
| Le signal de fluorescence des dendrites est faible | Attendez plus longtemps que la cellule se remplisse. Si une obstruction empêche la solution de patch de se diffuser dans la cellule, essayez d’appliquer une petite quantité de pression négative dans la pipette patch. |
| La stimulation électrique n’évoque pas de réponse Ca2+ | Vérifiez la présence d’un artefact dans l’enregistrement électrophysiologique. En cas d’absence, vérifiez qu’il n’y a pas de court-circuit/dysfonctionnement de l’unité de stimulation. Le cas échéant, augmentez l’intensité de la stimulation ou rapprochez la pipette de stimulation de la dendrite. Il est à noter que la distance entre l’électrode de stimulation et la dendrite ne doit pas dépasser 8 um pour éviter la dépolarisation directe des dendrites lors de l’étude des réponses synaptiques. |
| Le signal Ca2+ évoqué est trop élevé/sature l’indicateur Ca2+ | Réduire la puissance du laser. Si le problème persiste dans plusieurs cellules, utilisez un autre indicateur Ca2+ avec une affinité Ca2+ plus faible. |
| Le signal de base Ca2+ augmente progressivement au cours de l’expérience | Attendez une période plus longue entre les balayages individuels. Si la base de référence continue d’augmenter, arrêtez l’acquisition ; Cela indique que la santé de la cellule est probablement en déclin. |
| L’amplitude du signal Ca2+ diminue pendant les balayages | Réduisez la puissance du laser ou effectuez un zoom arrière (le cas échéant). |
| La dendrite se fragmente (« blebbing ») après le balayage | Réduisez la puissance du laser ou effectuez un zoom arrière. Si le blebbing est limité à la dendrite ciblée, choisissez une autre dendrite et réduisez la puissance du laser/zoom arrière. Si plusieurs dendrites brillent, arrêtez l’acquisition. |
| Les signaux de fluorescence « dérivent » hors de la ligne de balayage après les balayages | Réduire le mouvement dans la tranche en réduisant la vitesse de perfusion de l’ACSF. Avant de rapiécer, assurez-vous que la tranche est solidement fixée en place par un filet. |
