Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Assemblage de la pipette d’enregistrement-injection
- Tirez un capillaire en verre d’environ 7 cm de long (1 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur de pipette.
- Cassez l’extrémité capillaire et vérifiez l’ouverture au microscope optique. Vérifiez que le diamètre intérieur est compris entre 30 μm et 40 μm.
- Insérez un fil d’argent de 7 cm de long dans le capillaire en verre, avec environ 1 cm dépassant de l’extrémité non effilée de la pipette en verre.
- Pliez l’excédent de filament orthogonalement au capillaire de verre.
- Appliquez une gouttelette de colle plastique souple sur la tige d’une aiguille hypodermique de 30 G.
- Insérez une aiguille hypodermique de 30 G dans la pipette en verre selon les schémas présentés à la figure 1.
- Ajoutez une deuxième couche de colle pour assurer une bonne étanchéité de la jonction entre la pipette en verre et l’aiguille hypodermique.
- Laissez la pipette sécher avec la pointe vers le haut pendant environ 12 heures pour assurer un bon durcissement de la colle. Le résultat final est illustré à la figure 2.
REMARQUE : Cette procédure est effectuée dans les expériences aiguës, et la stérilisation de la pointe de la pipette n’est pas nécessaire.
2. Préparation des animaux
- Placez le rat dans une boîte d’anesthésie.
- Induire l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 4 % pendant 5 à 10 min.
- Placez l’animal sur une table stéréotaxique avec un coussin chauffant et une sonde rectale pour maintenir une température corporelle de 37 °C. Utilisez un cône nasal avec 2 % d’isoflurane pour maintenir l’anesthésie. Fixez la tête du rat à l'aide de barres d'oreille et d'un porte-dents.
- Appliquez une pommade ophtalmique ou des gouttes ophtalmiques, y compris des gouttes d’atropine à 1 %, pour aider à la dilatation de la pupille. Pour éviter le dessèchement, appliquez des gouttes lubrifiantes environ toutes les 30 minutes.
- Rasez la tête et nettoyez-la avec 10 % de povidone iodée.
- Pour une anesthésie locale, injectez 0,5 ml de lidocaïne à 2 % sous le cuir chevelu à 2-3 endroits en soulevant la peau et en insérant la pointe de l’aiguille.
- Confirmez un niveau d’anesthésie adéquat en effectuant un pincement des orteils et en observant l’absence de mouvement. De plus, la fréquence cardiaque doit être surveillée pour s’assurer qu’elle est dans les valeurs normales (300 à 400 battements/min).
- Incisez le cuir chevelu en ligne droite le long de la médiane avec une lame de scalpel #10 pour exposer les sutures coronaires et sagittales.
- Mettez en évidence les points Lambda et Bregma en écartant le tissu recouvrant le crâne à l’aide d’une spatule chirurgicale.
- Nivelez le crâne de manière à ce que les positions Bregma et Lambda soient sur le même plan.
- Pour régler le point de référence, utilisez un appareil stéréotaxique avec un tube de verre monté pour le placer juste au-dessus de Bregma. Il s’agira du « zéro » pour les coordonnées de mesure antéropostérieure et médiale-latérale.
- Définissez le point d’intérêt en déplaçant le support stéréotaxique aux coordonnées requises, notez les coordonnées stéréotaxiques et tracez un carré autour de la zone cible qui marque l’endroit où la craniotomie sera effectuée.
- Utilisez une perceuse chirurgicale avec une perceuse stérilisée le long du carré marqué, lentement sans pression pour retirer le matériau osseux. Attention à ne pas forer trop longtemps au même endroit, car cela produira de la chaleur et provoquera des lésions sur le cortex.
- Lorsque l’os délimitant la craniotomie est devenu suffisamment fin, retirez soigneusement la section crânienne à l’aide d’une pince à épiler pour exposer le cortex.
- Irriguer fréquemment le cortex exposé avec du liquide céphalo-rachidien artificiel pour prévenir la dessiccation des tissus.
note: L’élimination de la dure-mère n’est pas nécessaire sur le rat car l’extrémité de l’injecteur est suffisamment solide pour pénétrer.
3. Remplissage et montage du système d’injection
- Remplissez la microseringue de 5 à 10 μl par aspiration avec de l’huile minérale.
- Remplissez l’aiguille hypodermique avec la pipette en verre fixe avec une solution de Chicago Sky Blue (CSB) à 0,5 % et d’acide γ-aminobutyrique (GABA) à 300 μM ou une solution de lidocaïne à 2 % avec 0,5 % de CSB 9. Diluer toutes les solutions avec une solution saline.
- Dans le cas d’une substance abondante, remplissez à l’aide d’une seringue ordinaire et utilisez les techniques préventives habituelles pour éviter la formation de bulles d’air.
- Dans le cas de substances plus coûteuses, l’huile minérale peut être utilisée pour remplir l’injecteur, et l’agent chimique peut ensuite être introduit par aspiration. La différence de densité entre l’huile minérale et l’eau est relativement élevée, de sorte que cette substance est un bon candidat pour l’injection de solutions aqueuses.
note: Un colorant peut être ajouté pour confirmer la séparation entre les deux liquides.
- Pour remplir la pipette d’injection, aspirez une seringue de 1 ml avec la solution et injectez-la lentement dans la pipette.
- Portez une attention particulière aux fuites dans les régions indiquées à la figure 1 en frottant ces zones et en observant les fuites en injectant lentement la solution avec la seringue.
- Retirez la seringue de 1 ml. Ce faisant, maintenez une légère pression sur le piston afin que le vide n’élimine pas la solution de la pipette d’injection.
- Aspirez la microseringue avec de l’huile minérale et fixez-la fermement à la pipette d’injection remplie. Ensuite, essuyez soigneusement tout excès de solution de l’injectrode assemblé avec de la gaze.
- Injectez un très petit volume, suffisamment pour voir une petite goutte se former à l’extrémité de la pipette en verre, pour vérifier que l’embout n’est pas bloqué.
- Montez l’injecteur sur le système de micropompe et assurez-vous qu’il est bien fixé.
- Positionnez soigneusement l’embout injectrode aux coordonnées de la cible et abaissez l’embout à la surface du cortex.
- Abaissez lentement l’injectrode à l’aide de l’appareil stéréotaxique sur la structure cible (colliculus supérieur) en utilisant les coordonnées anatomiques appropriées.
- Couvrez le cortex exposé avec de la gélose chaude pour éviter la dessiccation des tissus.
4. Injection et inactivation réversible
- Réglez la pompe de micro-injection pour injecter 400 à 800 nl à 40 nl/min et appuyez sur Run pour démarrer l’injection. Notez que le taux de pointe montrera une réduction lors de l’injection.
REMARQUE : Dans la configuration expérimentale, l’activité neuronale s’est rétablie dans l’heure qui suit la fin de l’administration de GABA. Tout dispositif mécanique calibré peut être utilisé pour appliquer une pression sur la seringue de micro-injection et effectuer l’injection.
- Après avoir acquis les données électrophysiologiques, euthanasier en utilisant une méthode approuvée par la communauté locale d’éthique animale.
