Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des solutions
- Préparez 500 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel standard (ACSF) contenant les composants décrits dans nos travaux publiés, tels qu’énumérés dans le tableau 1.
- Utilisez des béchers en verre propres avec de l’eau déminéralisée pour préparer une solution fraîche d’ACSF. Nettoyez les spatules avec de l’eau déminéralisée et séchez-les avant utilisation pour ajouter du chlorure de sodium (NaCl), du chlorure de potassium (KCl), du phosphate de sodium dihydrogène (NaH2PO4), du bicarbonate de sodium (NaHCO3), du sulfate de magnésium (MgSO4), du D-glucose, et ajoutez le chlorure de calcium (CaCl2) après avoir fait bouillir la solution avec 95 % O2 / 5 % CO2pendant ~20 min (comme indiqué dans le tableau 1) à 500 mL d’eau désionisée. Remuer jusqu’à dissolution complète.
- Assurez-vous que l’ACSF est complètement dégagé sans aucune précipitation. Ensuite, ajustez le pH à 7,2-7,4. Bulle avec un mélange gazeux composé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2 pendant ~20 min.
- Préparez 250 mL de solution de coupe en tranches contenant les produits chimiques décrits au tableau 2.
- Ajouter le KCl, le chlorure de magnésium (MgCl2), le NaH2PO4, le NaHCO3, la choline·Cl et le D-glucose et ajouter le chlorure de calcium (CaCl2) en dernier comme indiqué au point 1.1.1 à 250 mL d’eau déminéralisée et dissoudre comme décrit aux points 1.1.1 et 1.1.2.
- Après avoir bouillonné avec 95 % O2/5 % CO2, placez la solution dans un congélateur pendant 15-20 min afin que la solution de coupe devienne glacée et partiellement congelée.
note: Nous utilisons cette solution de coupe lors de la fabrication de tranches de souris âgées de 1 à 2 mois ; La formule peut différer pour les souris de plus de 2 mois.
- Préparez une solution de lipopolysaccharide (LPS) en la dissolvant dans une solution saline isotonique stérile sans endotoxines (0,9 % NaCl). Le LPS est administré par voie intrapéritonéale (0,5 mg/kg) et commence à enregistrer 2 h plus tard.
2. Préparation de la tranche de cortex préfrontal
- Sortez la solution de coupe du congélateur et homogénéisez-la pour obtenir une gadoue. Placez la solution sur de la glace et faites bouillir constamment avec 95 % O2/5 % CO2.
- À l’aide de gros ciseaux tranchants, décapitez rapidement une souris comme décrit et mettez immédiatement la tête dans un bécher rempli d’une solution de coupe glacée (0-4°C).
- Coupez le haut du crâne le long de la ligne médiane dans le sens de la caudale au nez avec des ciseaux fins et retirez les parties latérales du crâne. Retirez la cervelle à l’aide d’une spatule fine et plongez-la dans une solution de coupe glacée.
note: Les étapes 2.2-2.3 doivent être effectuées rapidement (idéalement < 1 min).
- Placez le cerveau sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 9 cm remplie de glace. Rincez le cerveau avec une solution de coupe glacée. Coupez le cervelet et le bulbe olfactif avec une lame de rasoir.
- Appliquez de la colle cyanoacrylate sur le porte-échantillon d’un vibratome. Placez délicatement le bloc cérébral sur la goutte de colle, côté rostral vers le haut, et plongez-le immédiatement dans une solution de coupe glacée.
- Réglez le porte-lame du vibratome à un angle de 15° par rapport au plan horizontal et préparez des coupes de cerveau coronaires de 350 μm (fréquence de vibration de la lame = 85 Hz, vitesse = 0,1 mm/s).
- À l’aide d’une pipette, transvaser les tranches dans la chambre de récupération remplie d’ACSF, incuber pendant 1 h (à RT) avec un bouillonnement constant de 95 % O2/5 % CO2.
3. Enregistrement de patchs de cellules entières
- Fabriquez des micropipettes en verre borosilicaté à utiliser comme électrodes d’enregistrement ou des micropipettes soufflées conformément aux directives spécifiques du manuel d’utilisation de l’extracteur. Pour l’enregistrement des électrodes, les résistances de pointe sont comprises entre 4 et 6 MΩ, tandis que les micropipettes à soufflage ont des diamètres de pointe compris entre 2 et 5 μm.
- Ajouter un bloqueur de canaux Na+ (tétrodotoxine (TTX), 1 μM), pour bloquer les canaux Na+ rapides et donc les potentiels d’action, à l’ACSF et maintenir un débit constant de cette solution de 2-3 mL/min dans la chambre d’enregistrement, par pompe péristaltique dans la chambre et aspiration hors de celle-ci. Buller l’ACSF avec 95 % O2/5 % CO2 en permanence pour assurer la viabilité des tranches.
- Transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur modifiée dont la pointe fine a été coupée pour s’adapter à la taille de la tranche. Couvrez la tranche avec un ancrage de tranche de platine avec des fils de nylon parallèles espacés de ≥2 mm pour maintenir la tranche sur la plate-forme.
- Remplissez la micropipette enregistreuse avec la solution interne (tableau 3) et remplissez les micropipettes avec de l’acide gamma-aminobutyrique (GABA) à 10 μM, 50 μM et 100 μM (dissous dans l’ACSF), ou l’ACSF comme commande du véhicule.
- Pour éviter le blocage par des débris, appliquez une légère pression positive à l’aide d’une seringue de 1 ml avant d’immerger l’électrode d’enregistrement dans l’ACSF. À l’aide d’un micromanipulateur sous microscope (objectif 4x), positionnez l’électrode d’enregistrement et la micropipette de manière à ce que les pointes apparaissent au centre de l’image vidéo sur le moniteur (Figure 1A).
- Ajustez la mise au point du microscope (objectif 40x) tout en abaissant progressivement la micropipette et placez-la au-dessus du neurone enregistreur à un angle de 45°. Maintenez la distance entre l’extrémité de la micropipette et le neurone enregistrée entre 20 et 40 μm (Figure 1B). Approchez lentement et prudemment le neurone avec l’électrode d’enregistrement, puis relâchez la pression positive. Appliquez une aspiration faible et brève à travers le tube relié au porte-électrode pour créer un joint giga-ohm.
- Maintenez la tension à 0 mV. Après la formation de l’étanchéité giga-ohm, compensez la capacité rapide et lente manuellement ou automatiquement. Appliquez ensuite une aspiration brève et forte à travers le tube mentionné ci-dessus pour passer en mode cellule entière.
- Enregistrez eIPSC en mode pince de tension. Appliquez une faible pression de gaz (azote, 4 à 6 psi) sur la micropipette à bouffées à l’aide d’un Picospritzer contrôlé par un générateur de tension Master 8 pour délivrer des bouffées GABA simples ou appariées (Figure 2).
Table 1. Enregistrement ACSF.
| substance | g/mol | Concentration (mM) | Poids (g/L) |
| NaCl | 58.443 | 119 | 6,9547 |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | 26,2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120.366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-glucose | 198,17 | 11 | 2,1799 |
| CaCl2 | 110,98 | 2.5 | 0,2775 |
Tableau 2. Solution de coupe en tranches.
| substance | g/mol | Concentration (mM) | Poids (g/L) |
| Kcl | 74.551 | 2.5 | 0,1864 |
| MgCl2 | 95.211 | 7 | 0,6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1,25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | 2.1002 |
| Choline·Cl | 139,63 | 115 | 16.0575 |
| D-glucose | 198,17 | 7 | 1,3872 |
| CaCl2 | 110,98 | 0,5 | 0,0555 |
Table 3. Solution interne pour les enregistrements de patchs sur cellules entières.
| substance | g/mol | Concentration (mM) | Poids (g/L) |
| Gluconate de Cs | 328.052 | 100 | Référence 32.8052 |
| CsCl | 168,36 | 5 | 0,8418 |
| HEPES | 238.301 | 10 | 2,3830 |
| MgCl2 | 95.211 | deux | 0,1904 |
| CaCl2 | 110,98 | 1 | 0,1110 |
| BAPTA | 476.433 | 11 | 5,2408 |
| Na2ATP | 551.1 | 4 | 2,2044 |
| Na2GTP | 523.2 | 0,4 | 0,2093 |
