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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Solutions externes et internes
- Utiliser la solution de Ringer chez les mammifères lors de la dissection de la rétine et comme solution externe lors de l'enregistrement électrophysiologique ultérieur. Le jour de l'enregistrement, préparez la solution de Ringer pour mammifères à partir de 10 fois la solution mère (sans calcium) et ajoutez du CaCl2 goutte à goutte après 15 min de carbogénation (95 % d'O2 et 5 % de CO2). La solution finale 1x contient (en mM) : 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 et 10 D-glucose.
- Utilisez deux solutions internes pour caractériser les oscillations SAC. Testez l’utilité des solutions préparées dans des enregistrements prolongés de patch-clamps de cellules entières sur des cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) de souris adultes et stockez les lots vérifiés dans des aliquotes de 500 μl à -20 °C jusqu’à l’utilisation.
- Pour enregistrer l’oscillation potentielle membranaire, utilisez une solution interne à base de potassium qui contient (en mM) : 125 K-gluconate, 8 NaCl, 4 adénosine triphosphate (ATP)-Mg, 0,5 Li-guanosine triphosphate (GTP), 5 acide éthylène glycol tétraacétique (EGTA), 10 acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) et 0,2 % de biocytine (p/v). Ajustez le pH à 7,3 avec du KOH.
- Pour enregistrer les courants postsynaptiques excitateurs et inhibiteurs, utilisez une solution interne à base de césium contenant (en mM) : 100 Cs-méthanesulfonate, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES et 0,2 % de biocytine (p/v). Ajustez le pH à 7,3 avec du CsOH.
2. Préparation pour le jour de l’enregistrement
- Pour préparer une membrane de nitrocellulose avec des trous ouverts, perforez manuellement la membrane avec un perforateur personnalisé fabriqué à partir d’une aiguille de seringue émoussée de 16 G et aplatissez la membrane entre deux plaques de verre propres. Pour une rétine entière, faites un trou central de 0,2 mm de diamètre et entourez-le de 4 trous plus grands de 1 à 1,2 mm de diamètre.
- Pour fabriquer un filament de remblayage personnalisé pour charger la solution interne dans les électrodes, faites fondre une pointe de pipette de 10 μl au milieu et allongez doucement la partie fondue jusqu’à ce qu’elle refroidisse et durcisse. Juste avant l’utilisation, utilisez une lame de rasoir propre pour couper le filament jusqu’à ce qu’il soit légèrement plus long que les pipettes du patch.
- Tirez des pipettes patch dans un extracteur programmable à partir d’un tube en verre borosilicate avec un filament interne. Fabriquez les micropipettes le jour de l’expérience et utilisez-les immédiatement.
note: Pour l’enregistrement des SAC, nous utilisons le réglage d’extracteur suivant : chaleur : 484 ; traction : 0 ; vélocité : 25 ; temps de retard : 1 ; pression : 400 et une valeur de rampe de 462. Le diamètre extérieur (OD) et le diamètre intérieur (ID) des tubes borosilicatés sont respectivement de 1,65 mm et 1,0 mm. La résistance des pipettes est de 10-14 MΩ.
- Une heure avant le prélèvement des tissus, décongelez un tube de solution interne en le secouant sur un vortex pendant >30 min.
3. Dissection de la rétine
- Anesthésier l’animal avec 4 % d’isoflurane dans de l’oxygène jusqu’à ce que l’animal perde sa réactivité à un pincement des orteils. Sacrifier l’animal par luxation cervicale.
- Coupez les deux globes oculaires des nerfs optiques à 1-2 mm des têtes de nerf optique avec des ciseaux à iris à pointe droite.
- Roulez les globes oculaires sur une serviette en papier propre pour enlever le sang, puis plongez-les dans la solution de Ringer de mammifère carbogéné. Percez un trou dans le limbe avec une aiguille de 23 G et coupez les globes oculaires en deux en coupant le long du limbe avec des micro-ciseaux. Retirez la cornée et le cristallin à l’aide d’une pince fine.
- Pour le montage rétinien entier, décollez doucement toute la rétine de l’épithélium pigmenté avec une pince fine et faites quatre coupes orthogonales de 1,5 à 2 mm du bord vers la tête du nerf optique.
- Plongez une membrane de nitrocellulose perforée dans la parabole et faites glisser doucement la rétine dessus avec la couche de cellules ganglionnaires (GCL) vers le haut. Placez la tête du nerf optique dans le trou central lors de la préparation d’une rétine entière. Transférez la membrane avec la rétine dans un autre plat propre. Aplatissez doucement la rétine avec un pinceau fin pour qu’elle ressemble à une croix de Malte et posez les quatre bords sur les trous.
- Si une fraction de la rétine doit être examinée à la fois, coupez chaque œilleton préparé à partir de l’étape 3.3 en 3-4 morceaux avec une lame de rasoir avec l’épithélium pigmenté qui reste attaché. Protégez les pièces inutilisées de la lumière dans une solution externe carbogénée et utilisez-les dans les 12 heures.
- Épongez la membrane de nitrocellulose avec un morceau de papier filtre sec et retirez la membrane vitreuse et la membrane limitante interne à l’aide d’une pince et d’un pinceau.
- Assurez-vous que tous les bords rétiniens sont bien fixés à la membrane avant de transférer l’ensemble dans la chambre d’enregistrement avec une gaine en verre scellée au fond. Fixez la membrane avec de la graisse sous vide à la lamelle et réhydratez la rétine avec la solution externe. Veillez à ne pas coincer de bulles d’air sous l’ensemble.
- Placez la chambre sur la platine d’un microscope vertical. Perfuser la chambre avec une solution externe carbogénénée chaude (34-35 °C) à raison de ~3 ml par min.
- Examinez d’abord la rétine sous une lentille d’objectif 10x, puis utilisez une lentille à immersion dans l’eau 60x pour voir les neurones GCL et de la couche nucléaire interne (INL) sous contraste interférentiel différentiel (DIC) et/ou épifluorescence. Pour visualiser les SAC exprimant tdTomato, utilisez une source lumineuse à diode électroluminescente (LED) blanche en combinaison avec un filtre d’excitation de 554 nm et un filtre d’émission de 581 nm.
4. Enregistrement par patch clamp à cellules entières à partir d’une rétine à montage plat
- Filtrez la solution interne à travers un filtre à seringue dans le filament de remblayage personnalisé.
- Insérez le filament dans une micropipette fraîchement tirée et distribuez la solution interne près de la pointe jusqu’à ce que la solution recouvre le fil de l’électrode en argent sur >5 mm. Fixez la micropipette sur un porte-électrode muni d’une perche d’aspiration, à travers lequel la pression à l’intérieur de l’électrode peut être ajustée en poussant ou en tirant sur le piston d’une seringue en plastique de 10 ml reliée à un tube.
- Trouvez la pipette sous l’objectif et descendez-la à ~100 μm au-dessus de la rétine. En mode suiveur de courant (I = 0), utilisez le décalage CC pour mettre à zéro le signal de tension CC stationnaire. Mesurez la résistance de la pipette en mode pince de courant (IClamp) en injectant des courants d’onde carrée d’amplitude fixe à travers la pipette pendant qu’elle est dans le bain et neutralisez la différence en tournant le bouton Raccess. Utilisez la lecture sur le bouton Raccess pour calculer la résistance de la pipette par la loi d'Ohm.
- Amenez lentement l’électrode à ~10 μm au-dessus de la rétine. Appliquez une pression positive sur l’électrode. Observez le reflet changer près de la pointe de la pipette lorsqu’elle s’approche de la rétine. Forcez rapidement mais doucement la pipette dans le GCL et réduisez immédiatement la pression positive.
- Déplacez la pipette vers un neurone marqué. Évitez d’entrer en contact avec d’autres neurones, vaisseaux sanguins et extrémités des cellules de Muller. Appliquez plus de pression positive si nécessaire pour éviter le colmatage de l’électrode.
- Positionnez la pointe de la pipette près de la ligne médiane d’un neurone marqué jusqu’à ce qu’une fossette soit visible. Relâchez la pression positive et laissez la membrane plasmique rebondir sur la pointe de la pipette.
- Appliquez des courants négatifs de 20 à 120 pA à la pipette pour aider à la formation d’une étanchéité giga-ohm. Appliquez une légère aspiration si nécessaire pour tirer la membrane plasmique dans la pipette. Attendre 5 min après la formation du joint pour rompre la membrane cellulaire. Cela permet à la solution interne renversée d’être éliminée par superfusion. Rompre la membrane par une aspiration douce.
- Après la rupture de la membrane et en mode pince de courant, activez l’équilibre du pont et ajustez-le à l’aide du bouton Raccess.
note: Pour une petite cellule comme le SAC, seul un léger ajustement est nécessaire, le cas échéant. Alternativement, enregistrez les courants postsynaptiques excitateurs et inhibiteurs en mode de pince de tension (VClamp) en maintenant la cellule aux potentiels d’inversion du chlorure (environ -75 mV) et du glutamate (environ 0 mV), respectivement. Vérifiez et ajustez la position de la pipette si nécessaire pour tenir compte de la dérive occasionnelle de la rétine et/ou du micromanipulateur.
- Pour enregistrer le potentiel membranaire ou le changement de courant avant, pendant et après le traitement pharmacologique, préparez des bloqueurs synaptiques (par exemple, cyanquixaline [CNQX], (2R)-amino-5-phosphonopentanoate [AP5], picrotoxine, tubocurarine, etc.) et des modulateurs de canaux (par exemple, flupirtine, dopamine, acide méclofenamique, etc.) frais le jour de l’expérience à partir de stocks congelés. Diluez les médicaments avec une solution de Ringer carbogénée. Appliquez-les de manière progressive par perfusion.
- Après l’enregistrement, retirez délicatement la pipette du soma. Transférez l’ensemble de la chambre dans un plat propre. Détachez et rattachez la rétine sur une autre membrane de nitrocellulose aplatie sans trous perforés pour assurer la planéité de la rétine pendant la fixation.