Enregistrements électrophysiologiques pour l’évaluation des régénérations neuronales dans des coupes de moelle épinière co-cultivées

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Montage de coupes de tissu de moelle épinière sur des AEM

1. Réchauffer le milieu nutritif stérile dans l’incubateur (37 °C, couvercle légèrement dévissé pour l’oxygénation).
2. Positionnez le réseau multi-électrodes ou MEA à l’aide d’une pince à épiler stérile avec des pointes recouvertes de caoutchouc à température ambiante (RT) dans la boîte de Pétri sous un stéréomicroscope avec le réseau d’électrodes au point. Centrez une gouttelette de 6 μl de plasma de poulet sur le réseau d’électrodes propre, sans poussière et stérile. À l’aide d’une petite spatule, glissez avec précaution deux sections de la moelle épinière avec les côtés ventraux face à face dans la gouttelette de plasma. Ne touchez pas les électrodes avec la spatule.
3. Ajoutez 8 μl de thrombine autour de la gouttelette de plasma de poulet. À l’aide de l’embout de la pipette à thrombine, mélangez soigneusement et étalez le mélange de plasma de poulet/thrombine autour des deux tranches. Encore une fois, ne touchez pas directement le réseau d’électrodes cassant. Juste avant la coagulation, aspirez l’excès de plasma/thrombine de poulet.
4. Fermez la boîte de Pétri pour qu’elle conserve un taux d’humidité élevé pendant que l’ensemble MEA/culture repose pendant environ 1 heure dans une chambre humidifiée à l’intérieur de l’incubateur à 37 °C.
5. Ajoutez délicatement 10 μl de milieu nutritif dans la chambre de culture, bouchez la boîte de Pétri et remettez-la dans l’incubateur pendant environ 30 min.
6. Placez chaque ensemble MEA/culture avec des pointes stériles recouvertes de caoutchouc dans un tube à rouleau, ajoutez 3 ml de milieu nutritif et fermez bien le couvercle. Placez le tube du rouleau dans le tambour à rouleau, en tournant à 1 - 2 tr/min dans l’incubateur dans une atmosphère contenant 5 % de CO₂ à 37 °C.
7. Changez la moitié du milieu nutritif après 7 jours in vitro (DIV) et par la suite 1 à 2 fois par semaine.

2. Lésions mécaniques

1. Sortez l’ensemble MEA/culture avec des pointes stériles recouvertes de caoutchouc du tube roulant et placez-le dans une boîte de Pétri sans milieu nutritif sous un stéréomicroscope avec le tissu au point. Vérifiez visuellement que les deux tranches sont fusionnées.
2. Maintenez l’ensemble MEA/culture stable en plaçant une pince à épiler avec des pointes recouvertes de caoutchouc sur le MEA.
3. Placez une lame de scalpel dans la rainure du MEA près des tranches de tissu. Tenez le scalpel plutôt horizontalement.
4. Soulevez le manche du scalpel, mais laissez la lame du scalpel rester dans la rainure du MEA de manière à ce que la lame « roule » de la base à la pointe et coupe ainsi le tissu recouvrant le sillon.
5. Sévère toute connexion tissulaire résiduelle avec une pointe d’aiguille de 25 G si nécessaire. Ne travaillez que dans la zone à l’intérieur de la rainure et ne touchez pas les bords tendres.
6. Remettez l’ensemble MEA/culture dans le tube du rouleau. Fournissez 3 ml de milieu nutritif frais aux cultures et remettez-les dans le tambour à rouleaux de l’incubateur.

3. Enregistrements électrophysiologiques de l’activité spontanée

1. Pour étudier la régénération fonctionnelle entre les deux coupes de moelle épinière après le nombre choisi de DIV, montez l’ensemble MEA/culture dans une chambre d’enregistrement au microscope et appliquez environ 500 μl de solution extracellulaire (voir la liste des matériaux).
2. Attendez 10 min avant le premier enregistrement pour permettre au système de se stabiliser.
3. Enregistrez l’activité spontanée de base 2 fois pendant environ 10 minutes à partir de chaque électrode de détection d’activité de la MEA à RT.
4. Pour garantir des conditions extracellulaires stables, échangez la solution extracellulaire après chaque session d’enregistrement.
5. Pour désinhiber le réseau, appliquez une solution extracellulaire contenant de la strychnine (1 μM) et de la gabazine (10 μM). Attendez au moins 2 min avant de commencer l’enregistrement.

4. Analyse des données

REMARQUE : Pour la détection des potentiels d’action enregistrés extracellulairement, utilisez un détecteur basé sur les écarts-types et un discriminateur ultérieur pour chaque électrode.

1. Affichez l’activité neuronale détectée de chaque électrode dans un graphique raster selon les procédures standard (Figure 1F).
2. Déterminez et affichez l’activité totale du réseau pour chaque tranche en résumant le nombre d’événements dans les canaux appropriés dans une fenêtre glissante de 10 ms, décalée par pas de 1 ms/s (Figure 1G).
3. Détectez dans chaque tranche des rafales individuelles (grappes d’activité qui apparaissent sur plusieurs électrodes). Par conséquent, définissez un seuil d’activité de pointe minimal dans l’activité totale du réseau correspondante et définissez chaque début et fin de rafale. Par exemple, un seuil approprié est de 25 % de l’amplitude moyenne de la rafale, et un début de rafale peut être défini comme étant le premier événement d’une fenêtre de temps d’au moins 5 ms, et une rafale se terminant par le dernier événement d’une fenêtre de temps d’au moins 25 ms.
4. Pour quantifier la régénération fonctionnelle, calculez le pourcentage de rafales synchronisées entre les deux tranches. Pour ce faire, calculez la latence entre une rafale dans une tranche et la rafale suivante dans l’autre tranche.
   note: Une paire de rafales est dite « synchronisée » lorsque la latence est inférieure à la durée moyenne de la rafale. En particulier dans les co-cultures avec beaucoup d’activité, il est possible que les deux parties initient par coïncidence une rafale dans la fenêtre de latence choisie. Ce fait doit être pris en compte dans la quantification du pourcentage de sursauts synchronisés.

Graphique 1. Affichage et analyse de l’activité spontanée. a) Schéma d’une AEM. Les électrodes recouvertes de platine sont représentées en noir, les fils transparents en rouge et le sillon au milieu du MEA en jaune. (B) Gros plan du réseau d’électrodes situé au centre de l’AEM. (C) Image en fond clair d’une ancienne culture de la 8 DIV. Les tranches ont poussé et fusionné le long des côtés se faisant face. La barre jaune représente la rainure sans électrode ni isolation du MEA. Barre d’échelle = 400 μm (D) Chronologie des expériences. Deux tranches de moelle épinière d’embryons de rat E14 sont placées l’une à côté de l’autre sur des AEM. En quelques jours, les tranches poussent et fusionnent le long des côtés qui se font face. Dans un laps de temps de 8 à 28 DIV, des lésions complètes sont réalisées à travers le site de fusion. Deux à trois semaines plus tard, l’activité spontanée est enregistrée et les cultures sont fixées pour des colorations immunohistochimiques. (E) Traces d’activité spontanée de chaque électrode individuelle d’une culture ancienne de 23 DIV. Pour une visualisation plus claire, seule une trace sur deux est illustrée. Les traces orange représentent l’activité qui a été enregistrée à partir de la tranche du côté droit et les traces bleues du côté gauche. La plupart des rafales sont synchronisées entre les deux. La flèche pointe vers une rafale se produisant dans la tranche de gauche qui ne s’est propagée que partiellement à la tranche de droite. L’activité dans la tranche droite n’a cependant pas atteint le seuil choisi d’au moins 25 % de l’activité maximale moyenne de pointe du côté correspondant et n’est donc pas détectée comme un sursaut. Les grossissements sur la droite représentent la dernière paire de rafales synchronisée. (F) Un graphique matriciel de l’activité est illustré à la partie (E). (G) Graphique de l’activité du réseau avec des rafales définies (barres en dessous de la ligne de base) de l’activité indiquée en (E).