Excitation externe de cultures neuronales à motifs unidimensionnels

Dans cet article

Résumé

Source :Stern, S., et al. Excitation externe des neurones à l’aide de champs électriques et magnétiques dans des cultures unidimensionnelles et bidimensionnelles. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre une technique pour stimuler des cultures neuronales à motifs linéaires avec un champ électrique uniforme et unidirectionnel.

Protocole

1. Imagerie de l’activité spontanée ou évoquée dans des cultures neuronales avec des colorants fluorescents.

Préparez une solution de 50 μg de colorant fluorescent sensible au calcium (voir le Tableau des matériaux/réactifs) dans 50 μL de DMSO (diméthylsulfoxyde).
Préparer une solution d’enregistrement extracellulaire (EM) contenant (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 saccharose (pH 7,4).
Incuber une culture neuronale dans 2 mL d’EM avec 8 μL de la solution de colorant fluorescent sensible au calcium pendant 1 h. Protéger de la lumière et tourner doucement pour assurer une répartition homogène du colorant dans les cellules.
Remplacez la solution par de l’EM frais avant l’imagerie. L’imagerie fluorescente est illustrée à la figure 1.
Image dans un microscope à fluorescence avec filtres optiques pour l’imagerie par fluorescence calcique (pic d’excitation à 488 nm, pic d’émission à 520 nm), à l’aide d’une caméra et d’un logiciel capables de quantifier l’intensité de n’importe quelle région d’intérêt (ROI) dans le champ de vision du microscope.

2. Stimulation électrique des cultures

REMARQUE : La configuration de base de la stimulation électrique est illustrée à la figure 2. Une lamelle sur laquelle la culture neuronale a été cultivée pendant environ 14 jours est placée dans une boîte de Pétri sous un microscope à fluorescence. L’activité électrique des neurones est imagée à l’aide de colorants sensibles au calcium, tandis qu’une tension est appliquée par deux paires d’électrodes de bain positionnées à l’extérieur de la culture. Les électrodes sont pilotées par un générateur de signaux dont la sortie est amplifiée par un amplificateur à double canal. Le contrôle de tension pour la stimulation est préféré au contrôle de courant plus standard, car les vecteurs de champ électrique sont déterminés directement, ce qui permet d’ajouter et de combiner facilement des vecteurs. Cela nécessite une vérification minutieuse de l’uniformité du champ électrique, ce qui peut être effectué sur l’ensemble de l’échantillon dans le cas du contrôle de tension. Lors de l’utilisation du contrôle de tension, il faut veiller à éviter toute boucle de terre et à vérifier l’homogénéité du champ électrique.

Pour une stimulation électrique avec un champ électrique homogène, utilisez une paire de fils d’électrodes parallèles.
1. Utilisez des électrodes en platine d'une épaisseur de l'ordre de 0,005'' (127 μm). En cas d’utilisation avec les lamelles de 13 mm, assurez-vous que la distance entre les deux électrodes est d’environ 11 mm et positionnez les électrodes à 1 mm au-dessus de la culture.
  REMARQUE : Pour fabriquer le porte-électrode (Figures 3A), utilisez du polytétrafluoroéthylène (PTFE). Percez des trous étroits dans le PTFE pour insérer les électrodes. L’appareil doit être plus haut que la solution extracellulaire afin que l’extrémité supérieure, où les électrodes sont exposées, n’entre jamais en contact avec la solution. Pour l’isolation, utilisez de la colle époxy sur toute partie des fils d’électrode qui pourrait être exposée.
2. Utilisez une forme d’impulsion carrée avec un rapport cyclique de 50 %, sans composant CC pour éviter l’électrolyse. Variez la durée de l’impulsion entre 10 μs et 4 ms pour provoquer une stimulation efficace sans brûler la culture. Assurez-vous que l’amplitude est de l’ordre de ± 22 V (voir Figure 3). L’impulsion carrée peut être observée sur un oscilloscope connecté en parallèle aux électrodes.
  note: Pour faciliter la programmation de n’importe quelle forme d’onde souhaitée, utilisez un logiciel d’édition de forme d’onde commercial (voir Liste des matériaux). Entrez graphiquement la forme d’onde souhaitée et envoyez-la au générateur de formes d’onde.
Pour tester l’homogénéité du champ, utilisez une électrode de sonde. Utilisez une grille d’au moins 1 mm x 1 mm pour permettre à la sonde d’être déplacée dans la zone entre les électrodes et mesurez le potentiel électrique.
1. Mesurez le potentiel électrique. Utilisez

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Résultats

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Figure 1 : Exemple de traces de transitoires calciques imagés lors de sursauts de réseau synchrones. Une image de neurones qui ont été teints avant l’expérience avec un colorant calcique. B. Traces d’intensité en fonction du temps des ROI en A avec la couleur de la trace représentant la couleur de la bordure du ROI en A. Une forte augmentation de l’intensité synchronisée dans ...