Stimulation de cultures neuronales structurées par un champ magnétique

Résumé

Source : Stern, S., et al., Excitation externe des neurones à l’aide de champs électriques et magnétiques dans des cultures unidimensionnelles et bidimensionnelles. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre une méthode pour stimuler des cultures neuronales cultivées en un anneau circulaire à motifs sur une lamelle, en utilisant un champ magnétique variant dans le temps.

Protocole

1. Préparation des lamelles pour les cultures 1D.

1. Nettoyez les lamelles en verre par immersion dans une solution de base de piranha composée de 75 mL de DDW, de 25 mL de solution d’ammoniac à 25 % et de 25 mL de peroxyde d’hydrogène à 30 %. Placez la solution avec les lamelles en verre sur une plaque chauffante à ~ 50°C pendant 30 min, puis séchez les lamelles en verre avec de l’azote.
2. Tout d’abord, les lamelles sont recouvertes d’une fine pellicule de chrome (99,999 %) de 6 Å d’épaisseur, suivie d’une couche d’or de 30 Å (99,999 %), par dépôt en phase vapeur ou par pulvérisation.
   1. Pour atteindre un taux de pulvérisation de 0,05 à 1 Å/s, utilisez une machine à pulvériser avec 2 faisceaux d’électrolyse et un système de vide de 260 l/s avec des tailles cibles de 2 » et 4 ». Utilisez un étage de rotation qui peut aller de 0 à 100 coups par minute (RPM). Utilisez une puissance de pulvérisation en courant continu (CC) de 0 à 750 watts.
   2. Pour obtenir du plasma à une pression de 10 mTorr dans la chambre, faites pivoter l’appareil à 30 tr/min et utilisez de l’argon à 99,999 %.
   3. Faites fonctionner l’alimentation des pistolets de pulvérisation à une puissance de pulvérisation de 40 W DC pour le chrome, ce qui permet d’obtenir un taux de couverture de ~ 0,12 Å/s, et à une puissance de pulvérisation de 10 W DC pour l’or, ce qui permet d’obtenir ~ 0,28 Å/s.
3. À l’aide d’une échographie pendant 30 min, dissoudre 0,1 g de 1-octadécanéthiol dans 100 ml d’éthanol ABS AR. Placez les lamelles enrobées de Cr-Au dans cette solution pendant 2 h, puis lavez-les avec de l’éthanol ABS AR et séchez-les avec de l’azote.
4. Préparez une solution de 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) et de 3,5 g d'un copolymère tribloc (voir le tableau des matériaux/réactifs) en agitant pendant 1 à 2 h à 600 - 700 tr/min. Placez les lamelles dans la solution pendant 1 h. Lamles sèches avec de l’azote.
5. Graver mécaniquement le motif souhaité en grattant la couche de bio-rejet. Pour ce faire, utilisez un traceur à stylet, où le stylo est remplacé par une aiguille de gravure. Grattez le motif à travers les couches métalliques pour atteindre le verre sous-jacent. Contrôlez ce processus à l’aide d’un ordinateur pour obtenir un modèle souhaité reproduit. Les modèles formés par ce processus sont illustrés dans les figures 1 et 2.
6. Préparez une couche biocompatible de 100 ml de DB-PBS, de 3,5 g de copolymère tribloc, de 35,7 μL/mL de fibronectine et de 29 μl/mL de laminine.
   1. Stérilisez les lamelles à la lumière ultraviolette pendant au moins 10 min. Incuber les lamelles dans la solution biocompatible préparée pendant la nuit.
      REMARQUE : La couche biocompatible ne se formera que là où la couche de biorejet a été gravée à l’étape précédente.
   2. Le lendemain, lavez les lamelles deux fois avec du P-DBS. Incuber-les dans l’après-midi pendant la nuit. Les lamelles sont maintenant prêtes pour le placage cellulaire.

2. Maintenance des cultures neuronales.

1. Préparez un milieu changeant (CM) composé de (par ml) : 0,9 mL MEM+3G, 0,1 mL HI HS, 10 μL de 5-fluoro-2′-désoxyuridine (FUDR) avec uridine 100x.
2. Préparez le milieu final (FM) composé de (par ml) : 0,9 mL MEM+3G et 0,1 mL HI HS.
3. Remplacer PM par 1-1,5 mL de CM après 4 jours in vitro (DIV). À 6 DIV, remplacez 50 % du CM par du CM frais. À la DIV 8, changer le support à 1,5 mL FM, suivi d’un changement de 50 % de FM tous les 2 jours. Après environ une semaine, une activité synchrone spontanée émerge.

3. Imagerie de l’activité spontanée ou évoquée dans des cultures neuronales avec des colorants fluorescents.

1. Préparez une solution de colorant fluorescent sensible au calcium de 50 μg (voir le Tableau des matériaux/réactifs) dans 50 μL de DMSO (diméthylsulfoxyde).
2. Préparer une solution d’enregistrement extracellulaire (EM) contenant (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 saccharose (pH 7,4).
3. Incuber la culture neuronale dans 2 mL d’EM avec 8 μL de la solution de colorant fluorescent sensible au calcium pendant 1 h. Protéger de la lumière et tourner doucement pour assurer une propagation homogène du colorant dans les cellules.
4. Remplacer la solution par une EM fraîche avant l’imagerie. L’imagerie fluorescente est illustrée à la figure 3.
5. Image dans un microscope à fluorescence avec filtres optiques pour l’imagerie par fluorescence calcique (pic d’excitation à 488 nm, pic d’émission à 520 nm), à l’aide d’une caméra et d’un logiciel capables de quantifier l’intensité de n’importe quelle région d’intérêt (ROI) dans le champ de vision du microscope.

4. Stimulation magnétique des cultures

Remarque : La configuration de base pour la stimulation magnétique est illustrée à la Figure 1. En haut à droite est montré un microscope à fluorescence inversée qui est utilisé pour imager les colorants sensibles au calcium dans les neurones. La bobine magnétique (cercles bleus) est positionnée concentriquement à environ 5 mm au-dessus d’une culture d’anneau neuronal (contour bleu). Une bobine de ramassage (cercle rouge) sur la circonférence de la boîte de Pétri surveille la tension induite par l’impulsion magnétique. En haut à gauche est représentée la dynamique mesurée de la bobine du stimulateur magnétique (MS) avec une charge de tension de condensateur de 5 000 kV, telle qu’intégrée à partir de la bobine de captage. Le champ électrique induit (calculé pour un rayon d’anneau de 14 mm) est représenté en vert tandis que le champ magnétique est représenté en bleu. En bas, des images de la culture neuronale sont montrées. En bas à gauche se trouve une image en champ clair d’une lamelle de recouvrement de 24 mm à motifs. Les zones blanches sont les neurones. Le motif photographié se compose de cultures d’anneaux concentriques de différents rayons. En bas à droite se trouve un zoom sur un court segment des anneaux, montrant des neurones individuels. Pour une échelle, la largeur des anneaux est d'environ 200 μm.

1. Développez les neurones en anneau circulaire (gravé comme décrit en 1.5) pour la stimulation de la culture 1D. Utilisez un colorant fluorescent sensible au calcium pour l’imagerie calcique (comme décrit dans la section 3) avec une culture 1D structurée sur des lignes minces (170 μm) et longues (10 mm).
   1. Utilisez une bobine magnétique circulaire et placez une boîte de Pétri à environ 5 mm en dessous et concentrique avec la bobine. Utilisez une bobine personnalisée d’environ 30 mm (diamètre intérieur, diamètre extérieur de 46 mm) avec une inductance de L = 90 mH pilotée par un MS fait maison ou commercial chargé avec une tension maximale de 5 kV.
   2. Pour stimuler magnétiquement les cultures neuronales, une haute tension et un courant sont déchargés à travers une bobine conductrice à l’aide d’un interrupteur à courant élevé-haute tension. Le stimulateur magnétique (MS) peut être construit à l’aide de gros condensateurs, de l’ordre de 100 mF, pour obtenir une haute tension de 1 à 5 kV. Vous pouvez également utiliser un MS disponible dans le commerce (voir le Tableau des matériaux/réactifs).
      note: Utilisez un fil de cuivre rectangulaire recouvert de polyester de 0,254 mm d’épaisseur et 6,35 mm de large pour fabriquer une bobine maison. Tournez les fils sur des cadres sur mesure, isolés avec des fibres de verre, et coulés dans de l’époxy (voir Tableau des matériaux/réactifs). Vous pouvez également utiliser des bobines disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux/réactifs).

Résultats

Figure 1 : Schéma du dispositif utilisé pour la stimulation magnétique des cultures neuronales. En haut est représentée la bobine magnétique (cercles bleus), qui est située concentriquement à 5 mm au-dessus de la culture de l’anneau neuronal, placée dans une boîte de Pétri (contour bleu). Une bobine de ramassage (cercle rouge) positionnée sur la circonférence de la boîte de Pétri mesure la ten...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CaCl2 , 1M	Fluka	Référence 21098	Solution d’enregistrement extracellulaire
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	Référence 65146	Support de placage, Solution d’enregistrement extracellulaire
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cultures cellulaires
Fibronectine	Sigma-Aldrich	Réf. F1141	Bio-revêtement
Fluo4, AM	Technologies du vivant	Réf. F14201	Imagerie de l’activité spontanée ou évoquée
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changement de support
La gentamycine	Sigma-Aldrich	G1272	Médium de placage, Milieu changeant, Médium final.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	N° H0887	Solution d’enregistrement extracellulaire
HI HS	bi	Référence 04-124-1A	Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final
KCl, 3M	Merck	1049361000	Solution d’enregistrement extracellulaire
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020	Bio revêtement.
MEM x 1	Gibco	Référence 21090-022	Milieu de placage, Milieu changeant, Milieu final
Chlorure de magnésium , 1M	Sigma-Aldrich	Référence M1028	Solution d’enregistrement extracellulaire
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Solution d’enregistrement extracellulaire
Octadécanéthiol	Sigma-Aldrich	1858	Nettoyage des lamelles enrobées de Cr-Au (cultures 1D)
Saccharose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Solution d’enregistrement extracellulaire
uridine	Sigma-Aldrich	Référence U3750	Changement de support
Machine à pulvériser	AJA International, Inc	Série ATC Orion-5	Revêtement du verre avec de fines couches de métal
Traceur à stylet	Hewlett Packard	HP 7475A	Gravure du motif sur la lamelle revêtue
alimentation	matrice	MPS-3005 LK-3	Alimentation électrique de la machine de pulvérisation
époxy	Cognis	Versamid 140	Coulée de bobines faites maison
époxy	coquille	EPON 815	Coulée de bobines faites maison