Utilisation de réseaux de multiélectrodes pour mesurer la physiologie synaptique dans des sphères de coculture 3D

Mesure de la physiologie synaptique en direct à l’aide de réseaux multiélectrodes (MEA)

1. Préparer les AEM pour la culture cellulaire.

1. Nettoyez la surface de chaque MEA avec 1 mL de détergent pendant 1 h. Rincez à l’eau désionisée stérile (DI), rincez avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser, puis séchez à l’air libre dans une enceinte de biosécurité sous lumière UV.
   note: Les MEA peuvent être conservés dans de l’eau DI à 4 °C dans des conditions stériles jusqu’à leur utilisation.
2. Préparez une solution de poly-ornithine (PLO) à 0,5 mg/mL en dissolvant 50 mg de PLO dans 100 mL de tampon d’acide borique. Enduire la surface de chaque MEA avec 1 mL de PLO pour le rendre hydrophile et incuber à 37 °C pendant au moins 4 h. Retirez le PLO et lavez la surface avec de l’eau DI.
3. Diluer une solution d’enrobage de matrice extracellulaire (ECM) avec un milieu basal (DMEM/F12) pour préparer une solution mère à 1 mg/mL. Pour une solution fonctionnelle, remettre en suspension 3 mL de stock ECM dans 33 mL de support DMEM/F12 pré-réfrigéré, ce qui porte le volume total à 36 mL pour une concentration de 80 μg/mL.
4. Ajouter 1 mL de solution de travail ECM à chaque MEA et incuber à 37 °C pendant au moins 4 h.
5. Retirez l'ECM et placez les sphères dans 1,5 mL de support sur une surface MEA, en vous assurant que les sphères sont positionnées au-dessus du réseau d'électrodes (Figures 1A, 1A'). Laissez le support adhérer pendant 2 jours. Changez la moitié du support tous les 2 à 3 jours (ou plus souvent si nécessaire), en veillant à ce que les sphères ne soient pas perturbées.
   note: L’ajout de facteurs de croissance peut améliorer la survie et la maturation des cultures.

2. Mesurez l’activité électrique des sphères neuronales.

1. Mettez en place un système de réseau multiélectrodes (MEA) avec un étage de tête à température contrôlée. Créez un logiciel avec un filtre passe-haut 5 Hz, un filtre passe-bas 200 Hz et un seuil de pointe de 5x l’écart-type (SD).
2. Placez le MEA sur la scène et enregistrez l'activité électrique spontanée (Figure 1B, B'). Enregistrez les données brutes, y compris la fréquence et l’amplitude des pics, à des fins d’analyse statistique.
   note: Un système de perfusion peut être utilisé avec le MEA pour ajouter des agents pharmacologiques ou pour augmenter le débit de milieux frais pour l’enregistrement à long terme. Si vous le souhaitez, un post-traitement supplémentaire des pointes peut être effectué.

Figure 1 : Physiologie synaptique vivante représentative de sphères neuronales sur des réseaux de multiélectrodes (MEA). (A, A') Les MEA sont utilisés pour mesurer la physiologie synaptique en direct des sphères neuronales. Des sphères d'iNeurons (A) ou des cocultures d'iNeurons et de hAstros (A') peuvent être cultivées sur des surfaces MEA avec des substrats imitant l'ECM (voir étape 4.1). (B, B') Tracés raster de l’activité électrique spontanée représentative mesurée sur toutes les électrodes (axe vertical) pendant une fenêtre d’enregistrement (axe horizontal). Après 4 semaines de culture en milieu basal neurophysiologique41, les sphères iNeuron (B) ont montré des pics spontanés, tandis que les sphères de coculture (B') ont révélé une augmentation des rafales de réseau de modèles de décharge synchrones (flèches orange). (C, C') Histogramme des pointes mesurées pendant les fenêtres d’enregistrement MEA à partir d’électrodes représentatives. (D, D') Des tracés raster de l'activité électrique spontanée ont été mesurés sur toutes les électrodes après l'application de 50 μM CNQX, un antagoniste des récepteurs AMPA (même échelle de temps que B, B'). CNQX a éliminé la présence de rafales synchrones de pointes observées dans les cocultures (D'). (E, E') Histogramme des pointes mesurées pendant les fenêtres d'enregistrement MEA à partir d'électrodes représentatives après application de 50 μM CNQX (même échelle de temps que C, C'). (F) Carte des tracés de pointes des sphères iNeuron de toutes les électrodes au fil du temps (à gauche). Électrode unique démonstrative affichant plusieurs traces groupées au fil du temps (au milieu) ; Les traces de pointes individuelles peuvent être triées et analysées individuellement (à droite).