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1. Ablation d’une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope laser à deux photons
REMARQUE : Si les utilisateurs prévoient d’effectuer une imagerie Ca après l’ablation, utilisez la ligne UAShspzGCaMP6s. Si les utilisateurs prévoient d’effectuer un enregistrement comportemental après l’ablation, utilisez la ligne UAS :EGFP, car l’ablation des cellules EGFP positives est plus facile à réaliser que celle des cellules exprimant GCaMP6s.
- Commencez par mettre en place l’accouplement d’une lignée Gal4 qui marque les neurones spécifiques à étudier et les UAS :EGFP ou UAShspzGCaMP6. Assurez-vous d’utiliser le fond de nacre pour les deux parents afin que les homozygotes de nacre puissent être obtenus.
note: Les homozygotes de nacre ne contiennent pas de mélanophores à la surface du corps (Figure 1B). Dans la présente étude, une ligne Gal4 gSAIzGFFM119B (qui marque le prétectum) et une autre ligne Gal4 hspGFFDMC76A (qui marque l’ILH) sont utilisées.
- Le jour suivant de la configuration de l’accouplement, collectez les œufs de poisson-zèbre et élevez-les jusqu’au stade larvaire, moment où les neurones d’intérêt exprimeront des rapporteurs fluorescents.
- Montez la larve de poisson-zèbre dans de l’agarose à faible point de fusion à 2 % (Figure 1B).
- Commencez par préparer une solution mère d’agarose à 2 % : dissolvez 2 g de poudre d’agarose à bas point de fusion dans 100 ml d’eau de système (c’est-à-dire l’eau utilisée pour maintenir le poisson-zèbre adulte dans un système d’eau en circulation) ou de l’eau E3 en chauffant l’eau jusqu’au point d’ébullition au micro-ondes et en mélangeant vigoureusement.
- Passez au micro-ondes le bouillon d’agarose à bas point de fusion à 2 % jusqu’à ébullition. Versez 3,5 à 4,0 ml d’agarose sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 6 cm. Attendez que l’agarose refroidisse pour qu’elle soit chaude au toucher avant de continuer.
- Ensuite, placez une seule larve (non anesthésiée à cette étape) dans l’agarose. Continuez à ajuster la position et l’orientation de la larve de manière à ce qu’elle soit droite, à l’aide d’une aiguille de dissection (figure 1C), jusqu’à ce que l’agarose se solidifie pour assurer le bon positionnement de la larve.
note: La larve continuera à nager pendant que l’agarose se solidifie.
- Une fois la larve positionnée, attendez 5 min pour que l’agarose se solidifie complètement.
- Verser 5 mL de solution de tricaïne (0,4 % à 1x la concentration de travail) sur l’agarose.
note: Pour éviter les mouvements des larves lors de l’ablation au laser, les larves doivent être anesthésiées tout au long de la procédure d’ablation.
- Ablater la larve à l’aide de la fonction de blanchiment dans un système de microscopie laser à deux photons.
- Placez la larve incrustée d’agarose sous un microscope à balayage laser à deux photons et démarrez le système de microscopie.
- Démarrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur le bouton « On » de l’onglet « Laser » pour allumer le laser (Figure 1D). Attendez que l’état du laser passe de « Occupé » à « Verrouillé ».
- Dans l'onglet « Canaux », réglez la longueur d'onde du laser à 880 nm (puissance maximale : environ 2 300 mW) pour l'ablation EGFP, ou à 800 nm (puissance maximale : environ 2 600 mW) pour l'ablation GCaMP.
- Sélectionnez l’objectif 20X en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif. Cliquez sur l’onglet « Localiser », cliquez sur « GFP » pour modifier les voies optiques et visualiser directement la fluorescence à l’œil nu.
- Localisez le cerveau de la larve de poisson-zèbre au centre de la vue, puis cliquez sur l’onglet « Acquisition » pour revenir à la microscopie à deux photons.
- Pour enregistrer la condition « avant l'ablation », prenez une image z-stack avec l'objectif 20X à une vitesse de balayage rapide (pour éviter les dommages causés par la chaleur). Comparez plus tard les images prises avant et après les expériences d’ablation (Figure 2A). Pour obtenir une pile z, cliquez sur « Z-Stack » pour sélectionner l’option de pile z et développer l’onglet. Réglez la limite inférieure (cliquez sur le bouton « Définir en premier ») après vous être concentré sur l’extrémité ventrale du cerveau larvaire, et réglez la limite supérieure (cliquez sur le bouton « Définir en dernier ») après avoir mis l’accent sur la surface la plus dorsale du cerveau. Ensuite, cliquez sur le bouton « Démarrer l’expérience » pour exécuter l’acquisition d’images z-stack.
- Sélectionnez l’objectif 63X en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif.
- Cliquez sur l’onglet « Localiser » pour passer à la microscopie épi-fluorescente, localisez les cellules à ablater au centre de la vue à l’œil nu, puis cliquez sur l’onglet « Acquisition » pour revenir à la microscopie à balayage laser.
- Dans l’onglet « Mode d’acquisition », réglez la « Taille du cadre » sur 256 x 256. Cliquez sur « Live » et observez les neurones qui vous intéressent.
- En commençant par le côté le plus dorsal, trouvez un plan focal dans lequel les cellules à ablater sont nettes.
- Marquez une petite zone circulaire d'environ un tiers du diamètre de la cellule sur chaque neurone en tant que région d'intérêt (ROI) à l'aide de la fonction « Régions ».
- Réglez la vitesse de balayage sur 13,93 s/256 x 256 pixels (134,42 μm x 134,42 μm), ce qui correspond à un temps de séjour laser d’environ 200 μs/pixel, ou 200 μs/0,5 μm. Réglez également 4 répétitions ('Cycle d'itération : 4'). Vous pouvez également optimiser le nombre d’itérations et la vitesse de balayage afin d’obtenir une ablation suffisante.
- Exécutez la fonction « Blanchiment » pour l'ablation, en combinaison avec les fonctions « Séries chronologiques (2 cycles) » pour imager l'échantillon (avant et après l'ablation) et « Régions » (pour définir les ROI) ou des fonctions équivalentes dans le logiciel utilisé (Figure 1D).
- En comparant la première image (avant l’ablation) et la deuxième image (après l’ablation) dans le cycle des séries chronologiques, assurez-vous qu’après le blanchiment, la fluorescence dans les cellules ciblées diminue jusqu’à celle observée au niveau du bruit de fond (Figure 2B).
- Si la fluorescence est toujours présente après l’ablation, augmentez le nombre d’itérations.
- Ensuite, déplacez le plan focal légèrement plus profondément (c’est-à-dire vers le côté ventral) et choisissez le plan focal suivant où les cellules non ablatées apparaissent.
- Effectuez la fonction de blanchiment comme décrit ci-dessus (étape 1.9). Répétez ces étapes jusqu’à ce que toutes les cellules de la structure neurale d’intérêt aient été enlevées.
- Après avoir parcouru tous les plans focaux couvrant les structures neurales à ablater, vérifiez que les cellules ne sont pas en fluorescence abolie. Si certaines cellules sont encore fluorescentes en raison d’une ablation insuffisante, irradiez-les à nouveau au laser comme décrit ci-dessus.
- Si la larve doit être récupérée de l’agarose après l’irradiation laser, n’essayez pas de la forcer à sortir de l’agarose car cela pourrait endommager la larve. Au lieu de cela, faites soigneusement de minuscules incisions dans l’agarose autour de la larve perpendiculairement à la surface de son corps. Ensuite, attendez que la larve sorte de l’agarose d’elle-même lorsque l’anesthésique se dissipe.
- Passez à la larve suivante pour l’ablation ou effectuez des expériences de contrôle en utilisant une autre population de neurones qui ne sont pas impliqués dans le comportement étudié.
note: Ici, en tant que contrôle, les neurones du bulbe olfactif dans UAS :EGFP ; Les larves de gSAIzGFFM119B ont été ablatées au laser à l’aide du même protocole décrit ci-dessus (figure 2A, à droite).
- Comptez plusieurs heures ou 1 jour pour la récupération avant de passer à l’imagerie Ca (section 2) ou à l’enregistrement comportemental (section 3). Pendant ce temps de récupération, vérifiez la santé des larves (c’est-à-dire une nage spontanée normale, pas de dommages thermiques apparents autour de la zone ablatée, etc.) et retirez les larves montrant des signes de mauvaise santé.
2. Imagerie calcique pour enregistrer l’activité neuronale évoquée par la proie chez les larves de poisson-zèbre ablées par le prétectum
- Pour préparer une chambre d’enregistrement, placez un joint de chambre d’hybridation à joint sécurisé sur une lame de verre, avec le côté adhésif sur le verre, et retirez le joint supérieur.
note: Cela crée une petite chambre d’enregistrement de 9 mm de diamètre et de 0,8 mm de profondeur (figure 3A).
- Ensuite, placez un filet en nylon (taille de l’ouverture : 32 μm) sur un tube de 50 ml dont le fond est ouvert. Utilisez le capuchon pour fixer la maille sur le tube (Figure 3B).
- Préparez la paramécie (qui est la proie à utiliser comme stimulus visuel pour la larve).
note: Préparez la culture de paramécie (étapes 2.3.1 et 2.3.2) à l’avance.
- Procurez-vous à l’avance une culture de graines de paramécies auprès de sources commerciales ou de centres de bioressources universitaires.
- Cultivez la paramécie pendant plusieurs jours dans de l’eau contenant de la paille de riz autoclavée et une pastille de levure de bière sèche (Figure 3C).
- Versez successivement la culture de paramécie à travers 2 tamis (l’un avec une ouverture de 150 μm, suivi d’un autre avec une ouverture de 75 μm) pour éliminer les débris de la culture.
- Recueillir les paramécies dans le flux de l’étape précédente sur un treillis en nylon (ouverture de 13 μm).
- Suspendre de nouveau la paramécie sur le treillis de nylon dans un bécher en verre à l’aide d’une bouteille compressible d’eau du système (figure 3D).
- Rincez la maille (Figure 3B) dans l’eau du système 2 fois (Figure 3E).
note: Le but de cette étape est d’éliminer tous les odorants et savourants possibles contenus dans le milieu de culture de paramécie, car le but de la présente étude est d’observer l’activité neuronale visuelle.
- Placez une larve de poisson-zèbre dans la solution de tricaïne pour l’anesthésier.
- Montez une seule larve dans une agarose à bas point de fusion à 2 %.
- Tout d’abord, passez au micro-ondes 2 % d’agarose à bas point de fusion et ajoutez 1/10 de volume de tricaïne concentré 10x à l’agarose.
- Déposer une goutte d’agarose contenant de la tricaïne sur la chambre d’enregistrement (figure 3A).
- Après avoir confirmé que l’agarose n’est pas trop chaude, placez la larve anesthésiée (de l’étape 2.5) dans l’agarose, en enlevant immédiatement tout excès d’agarose afin que la surface de l’agarose semble légèrement convexe.
- Orienter rapidement la larve en position verticale à l’aide d’une aiguille de dissection (Figure 1C).
note: Ces procédures doivent être terminées en quelques secondes avant que l’agarose ne se solidifie.
- Une fois la larve bien positionnée, attendez 5 min pour que l’agarose se solidifie complètement. Ensuite, versez une goutte de 1x solution de tricaïne sur l’agarose.
- Retirez l’agarose autour de la tête de la larve de poisson-zèbre et faites de la place pour que la paramécie puisse nager à l’aide d’un couteau chirurgical. Pour ce faire, faites d’abord quelques petites entailles dans l’agarose (Figure 3F). Ensuite, retirez soigneusement l’excès d’agarose en versant doucement l’eau du système sur la chambre.
note: À cette étape, la tricaïne sera lavée.
- Ensuite, placez une paramécie dans la chambre d’enregistrement pour servir de stimulus visuel.
note: Lorsque la paramécie nage près de la tête de la larve de poisson-zèbre, elle provoque une réponse neuronale (Figure 3G).
- Placez la chambre d’enregistrement sous un microscope à épifluorescence équipé d’une caméra scientifique CMOS (Figure 3H) et choisissez un objectif 2,5X (Figure 3I).
- Collectez des enregistrements en accéléré des signaux de fluorescence GCaMP.
- Démarrez l’application d’acquisition d’images pour l’appareil photo équipé.
- Cliquez sur « Volet de séquence » et sélectionnez « Enregistrement du disque dur » dans le volet. Dans la section Paramètres de numérisation, réglez le « Nombre d’images » sur 900 ou tout autre nombre total d’images souhaité.
note: Si possible, utilisez un logiciel d’enregistrement time-lapse doté d’un module (ici, « Hard Disk Record ») qui permet d’enregistrer efficacement les données sur un disque dur.
- Dans le volet « Capture », réglez le temps d’exposition à 30 ms (c’est-à-dire 33,3 ips) et Binning 2 x 2.
- Sur l’écran tactile de contrôle du microscope, choisissez un ensemble de filtres pour la GFP, car le GCaMP a des spectres d’excitation/émission similaires à ceux de la GFP.
- Cliquez sur « Live » dans le volet Capture pour localiser la larve dans la vue et la mise au point de la caméra (Figure 4A), puis cliquez sur « Stop Live » et cliquez sur le bouton « Start ». Enregistrez le film au format .cxd ou dans tout autre format contenant des informations sur les conditions d’acquisition.
