Étude de l’excitabilité des neurones fluorescents à l’aide d’une pince à patch de cellules entières

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Électrophysiologie

REMARQUE : L’objectif de ce protocole est d’obtenir des enregistrements de cellules entières à partir de neurones de cellules pyramidales de couche II/III identifiés visuellement par l’expression de la GFP dans des cerveaux de souris électroporés par GFP (ou toute autre protéine fluorescente précédemment électroporée). En utilisant ce protocole, il est possible d’étudier l’effet d’une modification génétique introduite par l’IUE sur les propriétés électriques du neurone. L’acquisition de modes de décharge spécifiques est un processus progressif de différenciation qui implique l’expression dynamique d’un large répertoire de canaux ioniques et qui aboutit à l’expression de modes de décharge transitoires avant les stades postnatals tardifs. Par exemple, les réponses électriques matures ne sont pas observées dans les couches II/III du cortex somatosensoriel de la souris avant P16.

1. Conditions préalables pour les coupes aiguës
   1. Préparez 1 L d’ACSF en utilisant de l’eau de haute pureté (double distillation) contenant 119 mM de NaCl, 26 mM de NaHCO₃, 11 mM de glucose, 2,5 mM de KCl, 1,2 mM de MgCl₂, 2,5 mM de CaCl₂ et 1 mM de NaH₂PO₄. Titrez le pH à 7,3 - 7,4 avec du HCl ou du NaOH. Ajustez l’osmolarité à 290 mOsm.
   2. Buller l’ACSF avec du carbogène (95 % O₂/5 % CO₂) pendant 15 à 20 min à l’aide de tubes en téflon (~ 1 mm), pour stabiliser le pH à 7,3 - 7,4.
2. Conditions préalables à l’enregistrement sur cellule entière
   1. Assurez-vous que la station d’électrophysiologie est équipée d’une chambre d’enregistrement, d’un système de perfusion, d’un microscope, d’électrodes (d’enregistrement, de stimulation et de mise à la terre), de macro et de micromanipulateurs, d’une table rigide résistante aux vibrations et d’une cage de Faraday, d’un stimulateur, d’un amplificateur et d’un convertisseur analogique-numérique (A/N), d’un ordinateur avec logiciel d’acquisition et d’un filtre GFP (ou tout autre filtre fluorochrome) pour l’analyse des neurones génétiquement modifiés (Figure 1A).
   2. Préparez la solution intracellulaire, contenant 115 mM de gluconate de potassium, 2 mM de MgCl₂, 10 mM d’HEPES, 20 mM de KCl, 4 mM de Na₂ATP et 0,3 mM de Na₃GTP, ajustée à pH 7,2 par KOH et à 290 mOsm par KCl.
   3. Fabriquez des pipettes patch en tirant sur des capillaires en verre borosilicate. Préparez les électrodes patch à l’aide d’un extracteur de micropipette. Utilisez des capillaires en borosilicate (1,5 mm de diamètre extérieur, 0,86 mm de diamètre intérieur, 10 cm de longueur). Fabriquer des électrodes patch montrant des résistances de 3 à 10 MΩ lorsqu’elles sont remplies de solution intracellulaire.
   4. Perfuser la chambre d'enregistrement avec de l'ACSF à une vitesse de 2 mL/min. Maintenir la température de la chambre à environ 33 °C.
3. Enregistrement sur cellule entière
   1. Transférez les tranches dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur (coupez la pointe longue) ou d’un petit pinceau. Maintenez la tranche vers le bas avec une harpe. Perfuser constamment les tranches avec de l’ACSF à raison de 2 mL/min.
   2. Patchez un neurone GFP positif.
      1. Placez la tranche dans la chambre d’enregistrement et trouvez la zone d’intérêt à travers le microscope à faible grossissement (10X). Ensuite, trouvez une cellule GFP positive à patcher à l’aide de l’objectif 60x.
      2. Remplissez l’électrode d’enregistrement avec une solution intracellulaire. À l’aide de la seringue reliée au filtre (filtre de 4 mm) et de l’embout du micro-chargeur, remplissez l’électrode d’enregistrement avec une solution intracellulaire.
      3. Placez la pipette en verre dans le porte-pipette. Placez l’embout de la pipette dans le bain et concentrez-vous sur l’embout. Une fois la pipette dans le bain, appliquez une pression positive à travers le système de contrôle de la contre-pression.
      4. Patchez un neurone fluorescent (Figure 1B).
         1. Approchez-vous de la cellule d’intérêt sous guidage visuel tout en maintenant la contre-pression dans la pipette. À l’apparition d’une petite fossette à la surface de la cellule, relâchez la pression. À ce stade, un joint étanche (résistance supérieure à 1 GΩ) peut se former. Sinon, appliquez une légère pression négative (aspiration) pour le faciliter.
         2. Pendant la formation du joint, amenez la pince de tension de maintien à -60 mV. Une fois que le joint GΩ est formé, appliquez une impulsion d’aspiration pour rompre la membrane cellulaire sous la pipette et passez en mode cellule entière.
      5. Enregistrez l’activité à l’aide des conditions de pince de courant. Une fois en mode cellule entière, passez du mode pince de tension au mode pince de courant et commencez l’enregistrement. Par exemple, pour enregistrer l’excitabilité cellulaire, appliquez des injections de courant dépolarisant de 500 ms (100 - 400 pA).
         1. Calculez les taux de décharge en traçant le nombre de potentiels d’action le long du train pour augmenter les courants d’entrée.
            note: Le potentiel de la membrane au repos, la résistance d’entrée et la capacité de la membrane peuvent également être calculés à partir des enregistrements.

Graphique 1. Paramètres d’électrophysiologie et exemple de réponse de tir. A. La photographie montre la configuration électrophysiologique utilisée pour les expériences de patch clamp dans des coupes aiguës. L’installation est incluse dans une cage de Faraday pour éliminer le bruit, et l’équipement est au-dessus d’une table anti-vibration. Les contrôleurs des micromanipulateurs motorisés pour les électrodes sont observés à gauche. B. Neurone pyramidal d’une souris électroporée avec GFP, observé dans des conditions de fluorescence en fond clair et en vert. La pipette d’enregistrement fixée à une cellule GFP+ est perceptible. Barre d’échelle = 10 μm. Modèles de décharge d’un neurone de couche de contrôle électroporée CAG-GFP II-III montrant la réponse typique de pic régulier. La distribution des potentiels d’action se rapproche d’une distribution régulière le long de la durée du courant d’entrée (axe X).