Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Porcelets et manipulation des porcelets
- Utiliser des porcelets mâles et femelles de manière systématique et aléatoire pour éliminer tout facteur de confusion potentiel fondé sur le sexe, conformément aux directives ARRIVE.
REMARQUE : Étant donné que la période de croissance cérébrale maximale se situe dans les 3 à 5 jours suivant la naissance des porcelets, l’expérimentation est effectuée uniquement avec des porcelets âgés de 3 à 5 jours.
- Assurez-vous que les porcelets arrivent au vivarium au moins 24 h avant l’expérimentation pour permettre l’acclimatation à l’environnement.
note: Du personnel vétérinaire formé fournit des soins de routine aux animaux. Les porcelets sont gardés dans des cages individuelles à température maintenue et surveillées en permanence et reçoivent un substitut de lait complet sur le plan nutritionnel ad libitum pour prévenir l’hypoglycémie. Les porcelets sont également gardés sans substitut de lait (nil per os), pendant au moins 3 heures avant l’anesthésie et reçoivent des couvertures et des jouets pour assurer des niveaux normaux de stimulation. Si possible, gardez plusieurs porcelets dans la même cage pour permettre la socialisation.
2. Développement et personnalisation de réseaux de microélectrodes (MEA) pour les études de neurotoxicité induite par l’anesthésie (AIN) dans un modèle de porcelet
REMARQUE : Cette technologie utilise des AEM à base d’enzymes qui sont pré-enrobés d’enzyme et galvanisés avec du dichlorhydrate de m-phénylènediamine (mPD). Les électrodes ont été conçues sur mesure avec un arbre rigide de 40 mm et fabriquées pour être utilisées chez les porcelets (figure 1).
- Veuillez consulter la description détaillée de la préparation et de l’étalonnage de l’AEM (Figure 2).
3. Anesthésie et utilisation d’appareils stéréotaxiques personnalisés pour le porcelet
- Anesthésier les animaux à l’aide d’un poste d’anesthésie équipé d’un ventilateur et d’appareils de surveillance appropriés, et surveiller les paramètres physiologiques tels que l’oxymétrie de pouls, la pression artérielle non invasive, l’électrocardiographie et la température pendant toute la durée de l’expérience, comme décrit précédemment. Intuber et ventiler les porcelets et administrer une anesthésie au sévoflurane à 1 concentration alvéolaire minimale (environ 2,5-3 %) pendant 3,5 h. Assurez-vous que des membres du personnel de laboratoire formés sont présents pour ces expériences. La fourrure recouvrant la zone chirurgicale est enlevée à l’aide d’une tondeuse électrique avant la préparation de la peau.
note: La concentration et la durée de l’anesthésique utilisé permettent à l’expérience de simuler la durée de l’exposition réelle à l’anesthésie pendant une intervention chirurgicale. De plus, le sévoflurane est l’anesthésique général le plus couramment utilisé dans la population pédiatrique, ce qui rend l’enquête sur son innocuité de la plus haute importance.
- Avant de le placer dans le cadre stéréotaxique, commencer une dose de charge de rocuronium de 2,5 mg/kg et une perfusion de 1,5 mg/kg/h pour empêcher l’animal de bouger pendant qu’il est attaché dans le cadre.
- Placez le porcelet dans le cadre stéréotaxique spécifique au porcelet une fois qu’une profondeur d’anesthésie adéquate est confirmée par pincement des orteils.
- Fournir un rembourrage adéquat à l’intérieur du cadre stéréotaxique en plaçant le porcelet sur un coussin chauffant à air pulsé avec un rembourrage supplémentaire (p. ex., un positionneur fluidisé) pour prévenir les escarres.
- Placez les dents de la mandibule supérieure sur la barre de dent (Figure 3).
note: La barre dentaire doit être à un niveau suffisant pour maintenir le crâne très fermement en place.
- Fixez et serrez les barres d’oreille pénétrantes dans les oreilles, en prenant soin de vous assurer que le porcelet est en position médiane. Positionnez les extrémités pointues des prises latérales à l’intérieur du conduit auditif et insérez les barres d’oreille suffisamment fermement pour entendre le son « pop » associé à la pénétration de la membrane tympanique. Fixez fermement les barres d’oreille au crâne et insérez-les à la même profondeur de chaque côté afin d’éviter tout mouvement du crâne pendant l’expérience (Figure 4, panneau A).
note: Il est d’une importance vitale de garder le porcelet au chaud (~ 37,8-38,6 °C) et de surveiller en permanence la température pendant toute la procédure de maintien de la normothermie. Cela peut être accompli à l’aide d’une couverture et/ou d’une lampe chauffante. Assurez-vous de placer la lampe chauffante à une distance appropriée pour éviter de brûler la peau de l'animal.
- Créez une incision médiane de 4 à 6 cm le long du crâne en prenant soin d’éviter de marquer le crâne avec le scalpel. Une fois l’incision pratiquée, utilisez une rétraction douce et une dissection émoussée pour élever le cuir chevelu du crâne. Frottez doucement le crâne avec un tampon de gaze pour enlever tout tissu conjonctif et exposer les lignes de suture (Figure 4, panneau B).
note: Il n’est pas nécessaire de maintenir la stérilité pendant les expériences de non-survie. Cependant, la stérilité doit être maintenue pendant les expériences de survie.
- Réfléchissez davantage le cuir chevelu, si nécessaire, pour exposer la zone d’intérêt et déterminer l’emplacement prévu pour la craniotomie (Figure 5, panneau A). À l’aide d’une perceuse chirurgicale, créez une fenêtre de craniotomie d’environ 0,25cm2 (qui peut être plus grande ou plus petite selon les objectifs de l’expérience) recouvrant la structure d’intérêt, en prenant soin de ne pas blesser la dure-mère ou le cerveau sous-jacent (Figure 5, panneau B). Utilisez des ciseaux chirurgicaux fins pour exciser la dure-mère recouvrant le tissu cérébral (Figure 5, panneau C).
- Positionnez l’électrode aussi verticalement que possible sur le bregma en fixant le bras métallique de la tête au micromanipulateur de la stéréotaxe du porcelet. Abaissez l’électrode autant que possible sans toucher la surface du crâne. Notez les coordonnées du bregma (Figure 6, panneau A).
- Déterminer les coordonnées antéro-postérieure et médiale-latérale ainsi que la profondeur de la structure d’intérêt en ce qui concerne le bregma. Déterminez les coordonnées stéréotaxiques à l’aide d’un atlas stéréotaxique adapté à l’espèce et à l’âge. Dans ce cas, utilisez un atlas stéréotaxique développé spécifiquement pour les porcelets.
- Repositionnez l’électrode de manière à ce qu’elle ait l’emplacement antéro-postérieur et médial-latéral approprié, en veillant à ce que la microélectrode et l’appareil soient perpendiculaires à la surface. Placez l’électrode pseudo-référence sous le cuir chevelu en assurant le contact avec l’animal (Figure 6, panneau B).
- Lentement et doucement, abaissez l’électrode à la profondeur appropriée dans le cerveau à l’aide du bras stéréotaxique. Pour les 2 mm finaux, utilisez un micro-entraînement hydraulique pour entraîner l’électrode jusqu’à l’emplacement exact (Figure 6, panneau C).
note: La position de l’électrode doit recouvrir la fenêtre de craniotomie. La profondeur de l’électrode variera en fonction de la structure cérébrale d’intérêt. Il n’est pas nécessaire de fermer l’incision à la fin de la collecte de données dans les expériences de non-survie.
4. Mesure du glutamate extracellulaire sous anesthésie au sévoflurane
- Assurez-vous que le porcelet fait l’objet d’une surveillance physiologique continue tout au long de cette procédure. Les porcelets sont anesthésiés par inhalation (via un cône facial) en préparation de l’intervention.
- Après l’implantation du MEA, attendez 30 min pour permettre à l’électrode d’atteindre la ligne de base afin de vous assurer que la mesure correcte sera obtenue pendant 3 h (Figure 7).
- 0,25 % de bupivacaïne (1 mL/kg) est administré par voie sous-cutanée au site de la chirurgie pour la gestion de la douleur postopératoire. De plus, la buprénorphine à libération prolongée est administrée par voie sous-cutanée toutes les 72 heures au besoin.
