Préparation d’un modèle de rat pour évaluer l’intégrité de la voie visuelle à l’aide d’une configuration électrophysiologique

Résumé

Source : Nguyen, C. T. et al., Enregistrement simultané de l’électrorétinographie et des potentiels évoqués visuels chez des rats anesthésiés.J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la préparation d’un modèle de rat pour étudier la santé de la rétine et l’intégrité des voies visuelles. Le potentiel évoqué visuel, la référence d’électrorétinographie et les électrodes actives sont connectées au rat, puis alignées sur la plate-forme avec le rat devant le bol de Ganzfeld pour un éclairage rétinien uniforme et fermées la cage de Faraday pour éviter les interférences externes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Pré-implantation d’électrodes à potentiel évoqué visuel chronique (VEP)

REMARQUE : Si des signaux simultanés d’électrorétinogramme (ERG) et de VEP doivent être collectés, les animaux doivent être implantés chirurgicalement avec des électrodes VEP au moins 1 semaine avant la collecte du signal.

1. Stériliser le banc d’opération avant l’expérimentation en le nettoyant avec de la chlorhexidine (0,5 % dans de l’éthanol à 70 %). Autoclavez tout le matériel chirurgical avant utilisation. Couvrez l’animal avec un champ chirurgical stérilisé. Assurez-vous que tous les expérimentateurs portent des masques chirurgicaux, des blouses et des gants stérilisés.
2. Induire une anesthésie avec 3 à 3,5 % d’isoflurane avec O₂ à un débit de 3 L/min. Maintenir l’anesthésie à 1,5 % et 2 L/min tout au long de la chirurgie. Assurer une profondeur d’anesthésie suffisante en l’absence de réflexe de pincement de la patte.
3. Appliquez 1 % de carboxyméthylcellulose sodique sur la cornée pour prévenir le dessèchement des yeux.
4. Rasez une zone de 30 mm x 30 mm sur le front, à l’arrière des yeux et à l’avant des oreilles.
5. Placez l'animal sur un coussin chauffant (37 °C) pour maintenir la température corporelle et stabiliser la tête de l'animal à l'aide d'un cadre stéréotaxique.
6. Désinfectez trois fois la zone rasée avec de la povidone iodée à 10 %. Pour la région proche de l’œil, évitez d’utiliser des antiseptiques à base d’alcool, conformément à la norme de pratique établie par l’Association of Surgical Technologists.
7. Faites une incision médiane-sagittale sur la tête à l’aide d’un scalpel et à partir de celle-ci, excisez un cercle de ~ 20 mm de diamètre de tissu dermique pour exposer l’os crânien.
8. Retirez le périoste sous-jacent en grattant et en séchant avec de la gaze pour exposer les sutures crâniennes coronales et sagittales.
9. À l’aide d’une fraise dentaire fixée à une perceuse, trépanez deux trous (0,7 mm de diamètre, profondeur ~ 1 mm) à travers le crâne sur les deux hémisphères aux coordonnées stéréotaxiques : 7 mm caudale à brégale, 3 mm latérale à médiane.
10. Vissez des vis en acier inoxydable (diamètre 0,7 mm, longueur 3 mm, stérilisées à la chlorhexidine) dans les deux trous préfabriqués jusqu’à une profondeur de ~ 1 mm (2 mm de vis exposées) pour permettre un ancrage solide. Celui-ci entre en contact avec la dure-mère sans endommager le tissu cortical sous-jacent.
11. Préparez la zone chirurgicale pour l'amalgame dentaire en séchant l'os crânien avec de la gaze et en rétractant la peau lâche avec deux sutures 3 - 0 à ~ 4 et 8 heures.
12. Étalez de l’amalgame dentaire sur le crâne exposé pour fixer les électrodes à vis (vis en acier inoxydable décrites à l’étape 1.10) en place. Assurez-vous que ~ 1,5 mm des vis restent exposées pour l’enregistrement.
13. Retirez les sutures de rétraction.
14. Injecter du carprofène à 0,5 % par voie sous-cutanée (5 mg/kg) pour l’analgésie et une solution saline (chlorure de sodium 0,9 %, 1,5 ml) par voie sous-cutanée pour le remplacement liquidien.
15. Laissez les animaux se rétablir dans des cages séparées. Ne laissez pas un animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
16. Ne pas remettre l’animal en compagnie d’autres animaux avant qu’il ne se soit complètement rétabli de la chirurgie (minimum 5 jours).
17. Continuer à administrer du carprofène à 0,5 % par voie sous-cutanée pour l’analgésie (5 mg/kg) une fois par jour pendant 4 jours.
18. Enregistrez l’ERG et le VEP 1 semaine après l’opération.

2. Enregistrement ERG et VEP

1. Préparation de la collecte des données
   1. Utilisez un logiciel informatique pour déclencher simultanément un stimulus et acquérir des données selon les paramètres recommandés ci-dessous.
      1. Amplifiez les signaux (ERG : ×1 000, VEP : x10 000) avec le gain réglé en interne par un préamplificateur et un amplificateur isolés, et avec les deux yeux adaptés pour l’impédance.
      2. Réglez la fréquence d’échantillonnage de l’ERG à 4 kHz sur une fenêtre d’enregistrement de 650 ms (2 560 points), pour ce faire, cliquez sur l’onglet « base de temps » dans le logiciel d’acquisition de données (pour le nom et la version du logiciel, voir le tableau des matériaux), sélectionnez « 2 560 » pour les échantillons et « 500 ms » pour le temps qui renverra une fenêtre d’enregistrement de 650 ms.
         1. Utilisez la même méthode pour régler la fréquence d’échantillonnage du VEP à 10 kHz sur une époque de 250 ms. Prévoyez une ligne de base de pré-stimulus de 10 ms pour les enregistrements ERG et VEP. Pour ce faire, cliquez sur l’onglet « Configuration » ; sélectionnez « Stimulateur » pour faire apparaître une nouvelle fenêtre de dialogue ; dans cette fenêtre, sélectionnez « Pulse » dans la liste déroulante pour « Mode » ; et définissez la valeur de « delay » sur « 10 ms ».
      3. Réglez le filtrage passe-bande ERG sur 0,3 - 1 000 Hz (- 3 dB). Cela se fait en cliquant sur « Bio Amplifier » dans le logiciel d’acquisition de données. Réglez ensuite la valeur du « passe-haut » sur « 0,3 Hz » et la valeur du « passe-bas » sur « 1 kHz ».
      4. À l’aide de la méthode mentionnée ci-dessus à la section 2.1.1.3, réglez les paramètres passe-bande VEP sur 0,1 - 100 Hz (- 3 dB), comme recommandé par la Société internationale d’électrophysiologie clinique de la vision (ISCEV) pour les enregistrements VEP humains.

2. Préparation de l’électrode

1. Fabriquez sur mesure les électrodes ERG active/inactive et VEP active/inactive en fixant respectivement un fil d’argent ou une pince crocodile à un fil d’électrode. Obtenir une électrode de terre dans le commerce.
2. Pour les 4 électrodes sur mesure, coupez l’extrémité mâle de l’extension du fil de l’électrode. Retirez 1 cm du revêtement isolant extérieur en polytétrafluoroéthylène à l’aide d’une lame de scalpel en veillant à ce que le fil intérieur ne soit pas endommagé.
3. Pré-façonnez les électrodes inactives ERG en coupant une longueur de fil d’argent de 70 mm (0,3 mm d’épaisseur) et en formant une boucle de ~ 8 mm de diamètre pour encercler l’œil de rat. Préparez un cercle uniforme en façonnant la boucle sur une pointe de pipette de 1 ml.
4. Pré-façonnez des électrodes inactives VEP en coupant une longueur d’argent de 70 mm et en formant une ellipse de ~ 8 mm de diamètre dans le sens de la longueur pour s’accrocher aux incisives de rat.
5. Pré-façonnez les électrodes actives ERG en coupant une longueur de 30 mm de fil d’argent et en formant une petite boucle pour entrer doucement en contact avec la cornée du rat (~ 1-2 mm de diamètre)
6. Fixez solidement les électrodes (2 ERG actifs, 2 ERG inactifs, 1 VEP inactifs) au fil de l’électrode en entrelaçant l’argent avec le fil intérieur exposé.
7. Isolez l’excès de métal exposé avec du ruban adhésif pour réduire les artefacts photovoltaïques.
8. Sur l’ERG, les électrodes inactives collent un petit morceau de fermeture auto-agrippante (~ 5 mm × 20 mm) sur le ruban de masquage pour permettre une fixation stable à la sangle de cou des rongeurs.
9. Fixez la pince crocodile au fil intérieur des fils d’électrode pour rendre les électrodes VEP actives.
10. Avant les enregistrements, galvaniser les surfaces exposées des fils d’argent (c.-à-d. l’anneau inactif et la pointe active) avec du chlorure à l’aide d’une source de 9 V CC pendant 20 secondes pour améliorer la conduction du signal.
    1. Pour ce faire, plongez l’extrémité argentée du fil d’électrode ERG (agissant comme l’anode d’une pile primaire) dans une solution saline normale ; et connectez l’autre extrémité de ce fil d’électrode à la borne positive d’une pile de 9 V.
    2. Connectez un autre fil (la cathode) à la borne négative de la batterie et plongez également l’autre extrémité dans une solution saline. Débranchez après 20 secondes et observez que la pointe argentée du fil d’électrode ERG doit être recouverte uniformément de couleur blanche.
       REMARQUE : Préparez de nouvelles électrodes ERG pour chaque session expérimentale (~ jusqu’à 8 heures) pour assurer la perméabilité du revêtement de chlorure.

3. Préparation des animaux

1. Adaptez les animaux à l’obscurité pendant la nuit (≥ 8 heures) avant les enregistrements dans une pièce étanche à la lumière. Assurez-vous d’une adaptation maximale à l’obscurité en éteignant les lumières de la pièce et en fermant toutes les portes et tous les stores. Minimisez les fuites de lumière en plaçant des matériaux résistants à la lumière autour des jonctions des portes/fenêtres et en plaçant les écrans d’ordinateur à l’extérieur d’épais rideaux noirs.
2. Effectuez la préparation des animaux dans une pièce sombre à l’aide d’une diode électroluminescente rouge faible (LED ; 17,4 cd.m-2, λ_max = 600 nm) pour maintenir la sensibilité des bâtonnets.
3. Anesthésier le rat en injectant de la kétamine/xylazine (60 : 5 mg/kg) par voie intramusculaire. Confirmer une profondeur d’anesthésie suffisante par l’absence d’un réflexe de pincement de la patte.
4. Pour maintenir la sédation, administrer une dose supplémentaire d’anesthésie (50 % de la dose initiale) après 50 min si nécessaire.
5. Pour une anesthésie topique supplémentaire, appliquez une goutte de proxymétacaïne à 0,5 % sur chaque œil et clignez des yeux pour éliminer l’excès de liquide.
6. Pour la dilatation de la pupille, appliquez une goutte de tropicamide à 0,5 % sur chaque œil, puis séchez l’excès de liquide.

4. Positionnement des électrodes ERG et VEP

1. Placez l’animal sur la plate-forme ERG devant le bol Ganzfeld situé dans la cage de Faraday. Évitez d’utiliser un coussin chauffant électrique, car il peut introduire du bruit électrique dans les enregistrements électrophysiologiques.
   REMARQUE : La plate-forme est fixée à une plate-forme d’eau chauffée à circulation pour maintenir la température corporelle.
2. Fixez l’animal à la plate-forme à l’aide d’une bande d’attache auto-agrippante placée fermement mais pas étroitement autour de la nuque.
3. Accrochez l’électrode VEP inactive autour des incisives inférieures du rat anesthésié.
4. Positionnez les électrodes inactives ERG en encerclant l'anneau scléral de manière non invasive autour de l'équateur de l'œil. Stabilisez-le en fixant des électrodes à la bande de fixation auto-agrippante autour de la nuque. Répétez l’opération pour l’œil controlatéral.
5. Fixez les électrodes actives VEP en fixant des pinces crocodiles à des vis en acier inoxydable préimplantées sur le crâne.
6. Placez une petite goutte de carboxyméthylcellulose sodique à 1 % sur la cornée avant de placer l’électrode active ERG pour améliorer la qualité du signal.
   REMARQUE : Le liquide de viscose aide également à maintenir l’hydratation de la cornée tout au long de l’expérimentation afin de minimiser la formation de cataracte de type dessiccation chez les rongeurs.
7. Placez une petite goutte de carboxyméthylcellulose sodique à 1 % sur les incisives inférieures pour améliorer le contact de l’électrode inactive VEP et ainsi signaler la qualité.
8. Positionnez les électrodes actives ERG de manière à ce qu’elles touchent légèrement la surface cornéenne centrale à l’aide d’un micromanipulateur fixé à un bras stéréotaxique construit sur mesure.
9. Insérez 2 à 5 mm de l’électrode de l’aiguille de terre (acier inoxydable) par voie sous-cutanée dans la queue.
10. Si nécessaire, séchez tout excès de liquide de la paupière inférieure avant l’enregistrement pour améliorer la qualité du signal.
11. Faites glisser la plate-forme plus près du bol Ganzfeld en veillant à ce que les yeux de l'animal s'alignent avec l'ouverture du bol pour permettre un éclairage uniforme des deux rétines (voir étape 2.4.1).
12. Fermez la cage de Faraday pour réduire les bruits parasites.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince crocodile	Marque générique	HM3022	Clip en acier inoxydable de 26 mm pour connecter les électrodes à vis VEP aux câbles
Bioamplificateur	ADInstruments	N° ML 135	Pour l’amplification des signaux ERG et VEP
Carboxyméthylcellulose sodique 1,0 %	Allergan	CAS 0009000-11-7	Fluide visqueux pour améliorer la qualité du signal de l’électrode ERG active
Carprofène 0,5 %	Groupe de santé animale de Pfizer	N° CAS 53716-49-7	Nom commercial : Rimadyl injectable (50 mg/mL). Pour l’analgésie postopératoire, diluée à 0,5 % (5 mg/mL) dans une solution saline normale
Chlorhexadine 0,5 %	Laboratoires Orion	Référence 27411, 80085	Pour la désinfection des instruments chirurgicaux
Bain d’eau à circulation	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Pour le maintien de la température corporelle de l’animal anesthésié pendant la chirurgie et les enregistrements électrophysiologiques
Amalgame dentaire	DeguDent GmbH	64020024	Pour enfermer l’ensemble électrode-crâne afin de le rendre plus robuste
Fraise dentaire	Storz Instruments, Bausch et Lomb	#E0824A	Une tête de forage miniature de ~0,7 mm de diamètre pour faire un petit trou dans le crâne sur chaque hémisphère afin d’implanter des vis VEP
forer	Bosch	Série Dremel 300	Une perceuse automatique pour la trépanation
Fil d’électrode	Téléfacteur d’herbe	F-E2-30	Câbles en platine pour connecter les électrodes en fil d’argent à l’amplificateur
Cage de Faraday	sur mesure		Assure l’étanchéité à la lumière pour maintenir l’adaptation à l’obscurité. Encapsule la configuration Ganzfeld pour améliorer le rapport signal/bruit
Tampons de gaze	Multigate Medical Products Pty Ltd	57 à 100 milliards	Pour sécher l’incision chirurgicale et la surface exposée du crâne pendant l’opération
Sphère d’intégration de Ganzfeld	Photometric Solutions International		Stimulateur de lumière conçu sur mesure : 36 mm de diamètre, taille d’ouverture de 13 cm
VELCRO	VELCRO Australie Pty Ltd	Emballage réutilisable de marque VELCRO	Fermeture auto-agrippante pour fixer les électrodes et l’animal sur la plate-forme d’enregistrement
Isoflurane 99,9 %	Abbott Australasia Pty Ltd	NCA 26675-46-7	Nom exclusif : Isoflo(TM) Anathésique par inhalation. Anesthésique par inhalation de qualité pharmaceutique mélangé à de l’oxygène gazeux pour la chirurgie d’implant d’électrodes VEP
kétamine	Laboratoires Troy	Ilium Ketamil	Nom exclusif : Ketamil Injection, Marque : Ilium. Anesthésique de qualité pharmaceutique pour l’enregistrement électrophysiologique
LED Luxeon	Phillips Lighting Co.		Pour la stimulation lumineuse, vingt LED de 5 watts et une LED de 1 watt.
Micromanipulateur	Appareil de Harvard	BS4 50-2625	Maintient l’électrode active ERG pendant les enregistrements
Électrode à aiguille	Téléfacteur d’herbe	F-E2-30	Inséré par voie sous-cutanée dans la queue pour servir d’électrode de masse pour l’ERG et le VEP
Phényléphrine 2,5 % minimes	Bausch et Lomb	NCA 61-76-7	Instillé avec Tropicamide pour obtenir une dilatation maximale pour l’enregistrement ERG
Povidone iodée 10 %	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Nom exclusif : Bétadine, Antiseptique pour préparer la peau rasée à la chirurgie 10 %, 500 mL
Système d’acquisition de données Powerlab	ADInstruments	N° ML 785	Contrôle les LED
Proxymétacaïne 0,5 %	Laboratoires Alcon	CAS 5875-06-9	Pour l’anesthésie cornéenne lors des enregistrements ERG
Solution saline	Gelflex		Non injectable, pour la galvanoplastie des électrodes en fil d’argent
Logiciel de portée	ADInstruments	Édition 3.7.6	Déclenche simultanément le stimulus via le système Powerlab et collecte des données
Argent (fil rond fin)	A&E métal	0,3 millimètre	Utilisé pour fabriquer des électrodes ERG actives et inactives, et l’électrode VEP inactive
Vis en acier inoxydable	MicroFasterners		Tige de 0,7 mm de diamètre, 3 mm de longueur à implanter sur le cortex visuel primaire et servir d’électrodes VEP actives
Cadre stéréotaxique	David Kopf	Modèle 900	Un instrument stéréotaxique pour petits animaux permettant de localiser les cortex visuels primaires selon les coordonnées de l'atlas du cerveau de rat de 2007 de Paxinos et Watson
Lame chirurgicale	Swann-Morton Ltée	206	Pour inciser la zone de la peau recouvrant le cortex visuel primaire pour implanter les électrodes VEP
suture	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd		Suture tressée en soie 3-0 non résorbable, pour la rétraction cutanée lors de la chirurgie d’implantation d’électrodes VEP
Pommade oculaire à la tobramycine 0,3 %	Laboratoires Alcon	NCA 32986-56-4	Nom commercial : Tobrex. Pommade antibiotique prophylactique appliquée autour de la plaie cutanée après la chirurgie
Tropicamide 0,5 %	Laboratoires Alcon	NCA 1508-75-4	Nom exclusif : 0,5 % de collyre mydriacyle, instillé pour obtenir une mydriase pour l’enregistrement ERG
Xylazine	Laboratoires Troy	Ilium Xylazil-100	Anesthésique de qualité pharmaceutique pour l’enregistrement électrophysiologique
Pointe de pipette	Eppendorf Pty Ltd	Référence 0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, pour électrodes sur mesure
Lethabarb Euthanazia Injection	Virbac (Australie) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/mL de pentobarbital sodique pour l’euthanasie rapide
Microsoft Office Excel	Microsoft	version 2010	Tableur pour l’analyse des données