1. Configuration de l’appareil de pipette à soufflage
REMARQUE : Il y a cinq composants de base pour cette installation : la pipette en verre, le tube, la seringue, le micromanipulateur et le tampon (Hank's) Table 1. Tout tampon ayant des concentrations en sel physiologiquement pertinentes pourrait être utilisé dans cette configuration.
- Tirez une pipette en borosilicate pour avoir une pointe d’ouverture d’environ 45 μm de diamètre à l’aide d’un extracteur de micropipette et conformément aux spécifications du tableau 2.
REMARQUE : Il a été constaté que 45 μm est une taille appropriée pour le diamètre de l’ouverture de la pipette dans des conditions expérimentales. De légères variations dans la taille de l’ouverture ne devraient pas affecter de manière significative les résultats. Il est important de noter que des écarts plus importants par rapport à ce nombre devraient toujours fonctionner pour l’induction de la varicosité en ajustant la hauteur de la seringue qui est reliée à la pipette par un tube, mais cela nécessitera un recalibrage de la valeur de pression.
- Insérez l’extrémité non tirée de la pipette dans un tube en caoutchouc fin.
note: La paroi de la tubulure doit être mince et rigide pour minimiser la résistance du fluide, en veillant à ce que la hauteur de la seringue soit directement proportionnelle à la pression du fluide qui s’écoule à travers la pipette avec une résistance négligeable. Le tube ne doit pas dépasser environ 0,6 m de longueur pour minimiser davantage la résistance.
- Connectez l’autre extrémité du tube à une seringue en plastique de 10 ml à l’aide d’un connecteur avec une valve tournante.
note: La seringue en plastique doit être maintenue à une hauteur constante et mesurable pour assurer une mesure précise de la pression supposée s’écoulant de la pipette. Une hauteur de 190 mm a été utilisée car elle fournit une pression minimale mais induit de manière fiable des varicosités dans les axones. D’autres valeurs de hauteur peuvent également être utilisées si la pression provoque le détachement des cellules de la surface de la lamelle. Il est recommandé d’utiliser le même réglage tout au long de l’expérience.
- Insérez la pipette dans le haut de la vis du micromanipulateur pour maintenir la pipette en place. Vissez la vis métallique à sommet plat fixée au bras du micromanipulateur de manière à ce qu’elle maintienne l’extrémité non tirée de la pipette juste au-dessus de l’endroit où le tube en caoutchouc est fixé. Inclinez la pipette à un angle de 45° avec la surface des lamelles contenant les neurones. REMARQUE : Le micromanipulateur doit être construit de manière à ce que la pipette puisse être tenue sans serrer le tube en caoutchouc. Le micromanipulateur doit permettre le mouvement de la pipette dans les directions x, y et z pour la positionner avec précision à portée des cellules. Un graphique et une photographie de l’appareil sont présentés ci-dessous (figure 1).
- Allumez un filtre de fluorescence, ouvrez l’ouverture et assurez-vous qu’un point fluorescent peut être vu à travers l’objectif. À l’aide du micromanipulateur, déplacez la pipette dans une position qui aligne la pointe avec le point fluorescent et abaissez la pipette dans une position juste au-dessus de la hauteur de la boîte de culture cellulaire (35 mm x 10 mm). Une fois qu’il est en position, allumez la lumière transmise et désactivez la fluorescence.
- À l'aide d'une pince à épiler, ajoutez une lamelle (avec les cellules vers le haut vers la pipette) de la plaque de culture cellulaire dans la boîte de culture cellulaire contenant environ 2 ml de tampon Hank's à température ambiante.
- Placez la boîte de culture contenant la lamelle sur l’endoscope.
- À l’aide du bouton de mise au point fine et de l’objectif 20X, faites la mise au point sur un plan à environ quatre tours complets au-dessus des cellules (environ 0,4 mm). Utilisez le micromanipulateur pour positionner la pointe de la pipette de manière à ce qu’elle soit focalisée et au centre, sur le côté gauche du plan, comme on le voit à travers les oculaires.
note: Les dendrites sont des projections qui doivent être dans le même cadre que le corps cellulaire dont elles proviennent. Pour induire des varicosités axonales, il faut suivre des projections plus longues du corps cellulaire vers les axones médiaux et distaux.
2. Étalonnage de la pression de la pipette à l’aide d’un système de membrane extensible
- Installez l’appareil de pipette soufflante avec exactement les mêmes paramètres que ceux décrits ci-dessus sur un système contenant une membrane en silicone microfabriquée (500 μm de diamètre et 50 μm d’épaisseur) et focalisez le microscope sur la surface de la membrane.
note: Ce système a été conçu pour mesurer de petites valeurs de pression, et une explication du système a déjà été publiée. Cette mesure ne doit être effectuée qu’une seule fois pour les expériences de soufflage si le même réglage de soufflage est utilisé.
- Concentrez le microscope sur les réseaux de micropoints (de 4 m de diamètre et espacés de 10 m, mesurés entre les centres). Tournez la vanne d’arrêt et laissez le liquide s’écouler de la pipette. Examinez la déviation de la membrane en réponse à la pression du fluide à l’aide d’un microscope confocal.
- Utilisez un modèle linéaire pour déterminer la pression correspondante associée à la déviation de la membrane.
note: Bien qu’une étude récente ait révélé qu’une déviation de w= -3,143 ± 0,69 μm a été obtenue pour une hauteur de seringue de 190 mm, cela a produit une pression de 0,25 ± 0,06 nN/μm2 à partir de la configuration actuelle de la pipette, ce qui se situe dans la plage physiologique et pathologique, bien que la hauteur de la seringue ne soit pas le seul déterminant. D’autres facteurs influencent également la valeur exacte de la pression sur les neurones, notamment l’ouverture de la pipette, le positionnement (distance et angle) de la pointe de la pipette par rapport aux cellules, et même la flexibilité de la tubulure.
3. Souffler pour induire des varicosités
- Une fois la pipette en place, focalisez le microscope sur un plan qui contient une région d’intérêt. Positionnez les cellules et les processus dans la moitié gauche du champ d’imagerie (vue par la capture en direct de la caméra) à l’intérieur de la zone de soufflage, tandis que la moitié droite est à l’extérieur de la zone de soufflage.
note: En raison de la prolifération extensive des axones et des dendrites des neurones, il est peu probable que tous les processus d’un neurone se trouvent dans la même zone de soufflage. C’est d’ailleurs l’un des avantages de ce système, qui permet d’examiner l’effet local du soufflage. Il existe deux types de bouffées qui peuvent être utilisées pour induire des varicosités : la bouffée de longue durée et la bouffée pulsée.
- Souffler
- Bouffées de longue durée
- Positionnez la seringue à la hauteur, à 190 mm au-dessus de la lamelle contenant les neurones en culture. Commencez l’imagerie en accéléré de la zone d’intérêt avec un temps d’exposition optimisé révélant une morphologie neuronale claire. Capturez au moins 15 images à un intervalle de 2 s (30 s au total) comme référence. L’intervalle peut être ajusté en fonction de l’expérience. Au niveau du cadre 16, ouvrez la vanne d’arrêt tournante de la seringue et laissez le fluide s’écouler pendant 75 cadres (150 s). Au niveau du cadre 75, fermez la vanne afin que l’écoulement du fluide cesse. Arrêter la capture vidéo.
REMARQUE : Cela devrait induire des varicosités axonales dans les neurones 7-9 DIV en 5-10 s, tandis que les neurones plus anciens mettent plus de temps à former des varicosités.
- Soufflage par impulsion (durée 2 s)
- Positionnez la seringue à la bonne hauteur (190 mm). Commencez l’imagerie en accéléré et capturez au moins 15 images (30 s) à 2 s d’intervalle. Au niveau du cadre 16, ouvrez la valve de la seringue et laissez le fluide s’écouler, puis fermez la valve après 2 s. Attendez 5 à 20 s (selon la fréquence à tester) avant d’ouvrir à nouveau la vanne. Répétez l’ouverture et la fermeture de la vanne pour créer des impulsions de fluide, et continuez pendant une période totale de 150 à 300 s. Poursuivez l’imagerie en accéléré pendant 20 min pour capturer l’étape de récupération.
note: Lorsque l’intervalle est supérieur à 10 s, les impulsions induisent beaucoup moins de varicosités. À 20 s d’intervalle, aucune varicosité ne peut être induite par les impulsions. Pour obtenir une formation fiable et constante de varicosités, il est conseillé que la hauteur de la seringue soit d’environ 190 mm. La hauteur de la seringue et la pression du liquide ne doivent pas être augmentées au point où les cellules commencent à se détacher de la surface de la lamelle.
- Avant une journée d’utilisation, nettoyez l’installation (pipette, tube et seringue) en faisant couler environ 10 ml d’éthanol à 70 % à travers l’installation. Après le lavage à l'éthanol, versez 10 ml de tampon Hank's (ou du tampon souhaité) dans l'installation pour préparer le système à l'utilisation de la journée. Après avoir terminé les expériences de la journée, nettoyez l’installation comme décrit précédemment avec de l’éthanol pour empêcher la croissance des contaminants pendant la nuit.
Table 1 : Recette de tampon de Hank. Cette recette prépare le tampon utilisé dans le protocole de soufflage et lors de l’imagerie de cellules vivantes.
| tampon de Hank (filtre, pH = 7,4, conserver à 4 °C |
| 150 millions de mètres | NaCl |
| 4 millions d’euros | Kcl |
| 1,2 million d’euros | MgCl2 |
| 1 million d’euros | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glucose |
| 20 millions d’euros | HEPES |
Tableau 2 : Paramètres de tirage de la pipette. Fournit les paramètres à régler sur l’extracteur de pipette pour obtenir une ouverture d’environ 45 μm de diamètre.
| Paramètres de tirage de pipette |
| chaleur | tirer | vitesse | retarder | pression | rampe |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
