Électronique à maillage injectable pour des enregistrements stables d’un seul neurone dans le cerveau d’une souris

Résumé

Source : Schuhmann Jr., T. G., et al. Électronique à maille injectable par seringue pour l’électrophysiologie des rongeurs chroniques stables. J. Vis. Exp. (2018).

La vidéo montre l’injection de sondes électroniques maillées dans le cerveau d’une souris pour des enregistrements stables à long terme au niveau d’un seul neurone. Une souris anesthésiée avec un crâne exposé est fixée sur un cadre stéréotaxique, et la région du dispositif maillé de la sonde est injectée dans le cerveau à travers des trous percés. Les pastilles d'entrée-sortie de la sonde sont connectées à un circuit, et les enregistrements sont obtenus à l'aide d'un système d'acquisition de données.

Protocole

1. Injection stéréotaxique d’électronique maillée dans le cerveau d’une souris vivante

REMARQUE : Les souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale avec un mélange de 75 mg/kg de kétamine et de 1 mg/kg de dexdomiteur. Le degré d’anesthésie a été vérifié à l’aide de la méthode du pincement des orteils avant de commencer l’opération. La température corporelle a été maintenue en plaçant la souris sur une couverture homéotherme à 37 °C pendant l’anesthésie. Une technique stérile appropriée a été mise en œuvre pour la chirurgie, y compris, mais sans s’y limiter, l’autoclave de tous les instruments chirurgicaux métalliques pendant 1 heure avant utilisation, l’utilisation de gants stérilisés, l’utilisation d’un stérilisateur à billes chaudes tout au long de la chirurgie, le maintien d’un champ stérile autour du site chirurgical, la désinfection des instruments en plastique avec de l’éthanol à 70 % et la peau épilée du cuir chevelu a été préparée avec de l’iodophor avant l’incision. Pour les chirurgies de survie, après la fin de la chirurgie, une pommade antibiotique a été appliquée autour de la plaie et la souris a été renvoyée dans une cage équipée d’un coussin chauffant à 37 °C. Les souris n’ont pas été laissées sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Des souris ont reçu une analgésie à la buprénorphine par injection intrapéritonéale à une dose de 0,05 mg/kg de poids corporel toutes les 12 h pendant une période allant jusqu’à 72 h après la chirurgie. Des souris ont été isolées d’autres animaux après une intervention chirurgicale. Les souris ont été euthanasiées soit par injection intrapéritonéale de pentobarbital à une dose de 270 mg/kg de poids corporel, soit par perfusion transcardique.

1. Anesthésie la souris et fixe-la dans un cadre stéréotaxique.
2. Appliquez un lubrifiant oculaire sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Utilisez une perceuse dentaire et un cadre stéréotaxique pour ouvrir une craniotomie aux coordonnées souhaitées sur le crâne. Ouvrez une deuxième craniotomie loin du site d’injection pour l’insertion d’une vis ou d’un fil de mise à la terre en acier inoxydable.
4. Fixez un substrat de serrage au crâne avec du ciment dentaire. Découpez un espace d’environ 1 mm de large dans le substrat pour améliorer la fiabilité de l’étape de pliage plus tard dans la procédure.
   note: Un câble plat flexible (FFC) coupé en forme de « L » fonctionne bien (Figure 4A), bien que de nombreux matériaux fonctionnent à condition qu’ils soient de l’épaisseur correcte pour le connecteur ZIF (Zero Insertion Force) à 32 canaux (conçu pour les câbles de 0,18 ± 0,05 mm d’épaisseur).
5. Montez le support de pipette avec l’aiguille contenant l’électronique à maille sur le cadre stéréotaxique à l’aide d’une pince d’extrémité à angle droit (Figure 2C et Figure 3A).
6. Fixez la sortie latérale du porte-pipette à une seringue de 5 ml fixée dans un pousse-seringue (Figure 3D) à l’aide d’une longueur d’environ 0,5 à 1 m de tube capillaire.
   note: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le tube capillaire avant de le connecter au porte-pipette. Les bulles peuvent interrompre le flux pendant l’injection et empêcher une distribution fluide et contrôlée de l’électronique maillée.
7. Utilisez le cadre stéréotaxique pour positionner la pointe de l’aiguille à l’endroit de départ souhaité dans le cerveau.
   note: Les sondes électroniques à maillage utilisées ici sont conçues avec des électrodes d’enregistrement réparties sur une longueur d’environ 2 mm et avec la première électrode située à environ 0,5 mm du bord de départ de l’électronique à maillage (bord le plus à gauche sur la figure 1A). Pour cette raison, les coordonnées stéréotaxiques doivent être sélectionnées de manière à ce que l’emplacement de départ soit 0,5 mm plus profond que la région cérébrale d’intérêt. La répartition et l’emplacement des électrodes d’enregistrement dans l’électronique maillée peuvent être sélectionnés librement pendant le processus de conception du masque et doivent être sélectionnés de manière à ce que les électrodes d’enregistrement couvrent la ou les régions cérébrales d’intérêt lorsqu’elles sont injectées le long de leur trajectoire stéréotaxique.
8. Positionnez la caméra (Figure 3B) de manière à ce que la partie supérieure de la sonde électronique à mailles se trouve dans l’aiguille de verre. Certains logiciels permettent à l’utilisateur de tracer une ligne sur l’écran pour marquer la position d’origine de l’électronique maillée.
9. Initiez le débit en réglant le pousse-seringue à basse vitesse et en appuyant sur Start. 10 mL/h est un débit de départ typique pour une aiguille capillaire de 400 μm de diamètre intérieur. Augmentez lentement le débit si la sonde électronique à mailles ne bouge pas à l’intérieur de l’aiguille.
   note: Il est important de minimiser le volume de liquide injecté dans le cerveau, car cela peut endommager les tissus entourant le site d’injection. Les meilleurs résultats sont obtenus avec des volumes d’injection inférieurs à 25 μL par 1 mm de longueur de maille injectée. Les valeurs idéales sont inférieures à la moitié de ce volume ; dans notre laboratoire, nous injectons généralement 10 à 50 μL par une longueur de maille injectée de 4 mm.
10. Lorsque la sonde électronique à maille commence à se déplacer à l’intérieur de l’aiguille, utilisez le cadre stéréotaxique pour rétracter l’aiguille à la même vitesse que celle à laquelle la sonde électronique à maille est injectée, en utilisant la position d’origine marquée de l’électronique à maillage comme guide.
    note: Cette procédure, appelée méthode d’injection dans le champ de vision (FoV), permet d’administrer avec précision l’électronique du maillage à une région cérébrale ciblée sans froissement ni luxation. Souvent, le débit peut être réduit une fois que la sonde électronique à maille commence à se déplacer dans l’aiguille. Dans notre laboratoire, des débits de 20 à 30 ml/h sont souvent nécessaires pour surmonter le frottement statique entre le treillis et les parois de l’aiguille capillaire, mais le débit peut ensuite être réduit à 10 ml/h une fois le processus d’injection lancé. Les débits et les volumes d’injection sont généralement plus petits pour les aiguilles capillaires de plus petit diamètre.
11. Continuez à faire couler la solution saline et à rétracter l’aiguille jusqu’à ce que l’aiguille soit sortie du crâne. Arrêtez le débit de la pompe à seringue.

2. Interfaçage entrée/sortie

REMARQUE : À ce stade, la sonde électronique maillée a été injectée à partir du point de départ souhaité dans le cerveau le long de la trajectoire choisie. L’aiguille a été rétractée et se trouve juste au-dessus de la craniotomie, les interconnexions électroniques du maillage s’étendant du cerveau à l’aiguille et les coussinets d’entrée/sortie (E/S) restant à l’intérieur de l’aiguille (Figure 4B). Cette section utilise une carte de circuit imprimé (PCB ; Figure 4, Figure 5) pour s’interfacer avec la sonde électronique maillée. Le circuit imprimé connecte un connecteur ZIF à un connecteur d’amplificateur standard à 32 canaux à travers un substrat isolant qui devient l’étage principal pour les expériences d’enregistrement neuronal. Le circuit imprimé est personnalisable pour s’adapter à diverses configurations de tête. Nos fichiers de conception sont disponibles sur demande ou sur le site Web de ressources, meshelectronics.org, et peuvent être utilisés pour acheter des PCB à peu de frais auprès de fournisseurs de services de fabrication et d’assemblage de PCB.

1. Utilisez le cadre stéréotaxique pour guider soigneusement l’aiguille vers le substrat de serrage FFC et à travers l’espace, en faisant couler la solution avec la pompe à seringue pour générer du mou dans les interconnexions électroniques du maillage (Figure 4C).
2. Une fois que l’aiguille se trouve au-dessus du substrat de serrage et à travers l’espace, reprenez le flux à un rythme rapide pour éjecter les tampons d’E/S de l’électronique de maillage sur le substrat de serrage (Figure 4D).
3. À l’aide d’une pince à épiler et d’une pipette d’eau déminéralisée (DI), pliez les tampons d’E/S à un angle d’environ 90°, aussi près que possible du premier tampon d’E/S.
   note: La flexion est nécessaire pour permettre aux pastilles d’être insérées dans le connecteur ZIF d’un PCB lors d’une étape ultérieure. Le connecteur ZIF a exactement la même largeur que les 32 pastilles d’E/S de la sonde électronique maillée, de sorte qu’une courbure imparfaite à 90°, ou une courbure qui ne se produit pas juste avant la première pastille d’E/S, entraînera la coupure des pastilles d’E/S (les pastilles les plus à gauche de la figure 4E).
4. Une fois que les coussinets d’E/S sont alignés, dépliés et à un angle de 90° par rapport à la tige en maille, séchez-les en place avec de l’air comprimé qui circule doucement.
   note: Les sondes électroniques maillées avec moins de 32 canaux peuvent être interfacées avec la même carte d’interface à 32 canaux. Par exemple, notre laboratoire utilise couramment des sondes électroniques maillées à 16 canaux avec des circuits imprimés à 32 canaux. Cela permet d’obtenir un espace supplémentaire à l’intérieur du connecteur ZIF, ce qui facilite l’interface, et les canaux non contactés supplémentaires sont facilement identifiés comme des circuits ouverts au moyen de tests d’impédance pendant les sessions d’enregistrement.
5. Coupez le substrat de serrage sur une règle droite à environ 0,5 à 1 mm du bord des patins d’E/S. Coupez également les parties superflues du substrat de serrage qui gêneront l’insertion dans le connecteur ZIF à 32 canaux monté sur circuit imprimé (Figure 4F).
6. Insérez les pastilles d’E/S dans le connecteur ZIF du circuit imprimé et fermez le loquet (Figure 4G). Utilisez l’électronique de mesure pour mesurer l’impédance entre les canaux et la vis de terre afin de confirmer la réussite de l’interface. Si les valeurs d’impédance sont trop élevées, déverrouillez le connecteur ZIF, ajustez l’insertion et testez à nouveau jusqu’à ce que la connexion soit confirmée.
7. Couvrez le connecteur ZIF et les interconnexions électroniques à maille exposée avec du ciment dentaire pour la protection. Retournez le circuit imprimé au niveau de l’espace dans le substrat et fixez-le avec du ciment sur le crâne de la souris (Figure 4H).
   note: La flexion du FFC au niveau de l’écart réduit la contrainte mécanique qui peut parfois rompre les interconnexions électroniques du maillage.
8. Laissez le ciment durcir, transformant le circuit imprimé en un étage de tête robuste et compact pour l’interfaçage lors des sessions d’enregistrement ultérieures (Figure 4I).

3. Expériences d’enregistrement neuronal

1. Placez la souris dans un tailveiner ou un autre dispositif de contention. Insérez le circuit imprimé du préamplificateur dans le connecteur d’amplificateur standard du circuit imprimé de l’étage principal. Utilisez un câble séparé pour mettre à la terre la vis de référence.
2. Pour les enregistrements restreints, laissez la souris dans la limite. Enregistrez les données à l’aide du système d’acquisition de données pour la période souhaitée (figure 5A).
3. Pour des enregistrements en mouvement libre, relâchez la souris de la retenue après avoir inséré le circuit imprimé du préamplificateur et mis à la terre la vis de référence. Enregistrez pendant la durée souhaitée à l’aide du système d’acquisition de données pendant que la souris se comporte librement (Figure 5B)

Résultats

Figure 1 : Photographies et images au microscope optique de l’électronique maillée plug-and-play.(A) Images au microscope optique en mosaïque d’une sonde électronique à maille injectable par seringue avec E/S plug-and-play. La sonde a été imagée après l’achèvement des étapes de fabrication de la figure 2, mais avant la libération du substrat revêtu de Ni. Les ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Châssis stéréotaxique motorisé	Instruments de précision mondiaux	MTM-3	Pour la chirurgie stéréotaxique de la souris
Contrôleur d’enregistrement 512 canaux	Intan Technologies	Réf. C3004	Un composant du système d’enregistrement neuronal
RHD2132 carte d’amplification	Intan Technologies	Réf. C3314	Un composant du système d’enregistrement neuronal
RHD2000 Câble d’interface SPI ultra mince de 3 pieds	Intan Technologies	Réf. C3213	Un composant du système d’enregistrement neuronal
Dispositif de contention de souris	Braintree Scientific	TV-150 STD	Diamètre intérieur standard de 1,25 pouce, utilisé pour retenir la souris pendant les sessions d’enregistrement restreintes.
Aiguilles capillaires en verre	Drummond Scientific Co.		Diamètre intérieur 0,40 mm, diamètre extérieur 0,65 mm. D’autres diamètres sont disponibles.
Porte-micropipette type U	Dispositifs moléculaires, LLC	1-HL-U	Utilisé pour maintenir les aiguilles capillaires en verre lors de l’injection stéréotaxique
Seringue de 1 mL	NORM-JECT,® Henke Sass Wolf		Utilisé pour le chargement manuel de l’électronique du maillage dans les aiguilles capillaires
Tube de cathéter intrademic en polyéthylène	Becton Dickinson et compagnie		Diamètre intérieur 1,19 mm, diamètre extérieur 1,70 mm
Seringue de 5 ml	Becton Dickinson et compagnie		Utilisé dans le pousse-seringue pour l’injection d’électronique de maille in vivo
Caméra oculaire	Thorlabs Inc.	DCC1240C	Utilisé pour visualiser l’électronique du maillage dans les aiguilles capillaires pendant l’injection
Logiciel d’acquisition d’images ThorCam uc480 pour caméras USB	Thorlabs Inc.		Utilisé pour visualiser l’électronique du maillage dans les aiguilles capillaires pendant l’injection
Pousse-seringue	Appareil de Harvard	Doctorat 2000	Utilisé pour faire circuler des volumes précis de solution à travers des aiguilles capillaires lors de l’injection de l’électronique à maille
Foret dentaire EXL-M40	Osada	Référence 3144-830	Pour le forage de la craniotomie
Fraise de perçage de 0,9 mm	Outils scientifiques fins	Référence 19007-09	Pour le forage de la craniotomie
Stérilisateur à billes chaudes 14 cm	Outils scientifiques fins	Référence 18000-50	Utilisé pour stériliser les instruments chirurgicaux
Instrument de cryosectionnement CM1950	Microsystèmes Leica		Utilisé pour couper les tissus congelés en sections. De nombreuses universités ont
Pince d’extrémité à angle droit	Thorlabs Inc.	RA180/M	Utilisé pour fixer le porte-pipette au cadre stéréotaxique
Carte de circuit imprimé (PCB)	Circuits avancés		Utilisé pour l’interface entre l’électronique de maillage et l’électronique de mesure périphérique telle que le système d’enregistrement Intan. Advanced Circuits et d’autres fournisseurs fabriquent et assembler des circuits imprimés à partir des fichiers de conception fournis. Nos fichiers de conception de circuits imprimés sont disponibles sur demande ou sur le site ressource meshelectronics.org
Connecteur d’amplificateur standard 32 canaux	Omnetics Connector Corp.	Référence A79024-001	Composant assemblé sur le circuit imprimé
Câble plat flexible (FFC) 32 canaux	Molex, LLC	152660339	Utilisé comme substrat de serrage lors de l’interfaçage avec des pastilles d’E/S électroniques maillées avec le connecteur ZIF monté sur circuit imprimé
Connecteur à force d’insertion nulle (ZIF) à 32 canaux	Hirose Electric Co., LTD	FH12A-32S-0.5SH(55)	Composant assemblé sur le circuit imprimé