Etablissement d’une configuration de tension de cellule entière pour les enregistrements électrophysiologiques dans des tranches de cerveau

Résumé

Source : Sunstrum, J. K., et al. Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de l’électrophysiologie par patch-clamp de cellules entières. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre le positionnement d’une pipette à pointe fine près de tranches de cerveau, formant un sceau avec une cellule neuronale. L’aspiration brise la membrane cellulaire, créant ainsi une pince patch pour cellules entières qui permet des mesures de courant pour les expériences d’électrophysiologie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Solutions

1. Solution de tranchage
   1. Reportez-vous au tableau 1 pour la composition de la solution de tranchage.
   2. Préparez à l’avance une solution mère 20x et conservez-la à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   3. Pour la solution de tranchage 1x, dissolvez le NaHCO₃, le glucose et le saccharose dans ddH₂O et ajoutez le stock 20x. Assurez-vous que l’osmolarité est comprise entre 315 et 320 mOsm et conservez la solution pendant 1 semaine au maximum à 4 °C.
   4. Remplissez deux béchers avec 100 ml de solution à trancher et couvrez-les de parafilm. Réfrigérez la solution dans un congélateur jusqu’à ce qu’elle soit partiellement congelée (environ 20 min dans un congélateur à -80 °C). À l’aide d’un tube à dispersion de gaz, faites buller les deux béchers de solution de tranchage avec 95 % d’O2/5 % de CO2 pendant 20 min sur de la glace.
2. aCSF (liquide céphalo-rachidien artificiel), pour la récupération et l’entretien des tranches
   1. Voir le tableau 1 pour la composition du LCAP.
   2. Préparez à l’avance une solution mère 20x et conservez-la à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   3. Pour 1x aCSF, dissoudre le NaHCO3 et le glucose dans ddH2O et ajouter le stock 20x. Assurez-vous que l’osmolarité est comprise entre 298 et 300 mOsm. Utilisez la solution dans un délai de 1 jour.
3. aCSF (faible Ca²⁺ pour l’enregistrement)
   1. Voir le tableau 1 pour la composition du LCR aA à faible teneur en Ca²⁺.
   2. Préparez à l’avance une solution mère 20x et conservez-la à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   3. Pour 1x faible Ca²⁺ aCSF, dissoudre le NaHCO3 et le glucose dans le ddH2O et ajouter 20x (sans CaCl2 et MgCl2) stock, CaCl2 et MgCl2 aux concentrations spécifiées. Assurez-vous que l’osmolarité est comprise entre 298 et 300. Utilisez la solution dans un délai de 1 jour.
4. aCSF (Sr²⁺ pour l’enregistrement)
   1. Voir le tableau 1 pour la composition du LCA Sr²⁺.
   2. Préparez à l’avance une solution mère 20x et conservez-la à 4 °C jusqu’à 1 mois.
   3. Pour 1x Sr²⁺ aCSF, dissoudre le NaHCO3 et le glucose dans le ddH2O et ajouter 20x (sans CaCl2 et MgCl2) stock, SrCl2 et MgCl2 aux concentrations spécifiées. Assurez-vous que l’osmolarité est comprise entre 298 et 300. Utilisez la solution dans un délai de 1 jour.
5. Solution interne
   1. Reportez-vous au tableau 1 pour la composition de la solution interne à base de K-gluconate.
   2. Pour préparer 20 mL de solution interne, ajoutez 15 mL d’eau de biologie moléculaire dans un tube de 50 mL. Ensuite, effectuez les étapes suivantes sur de la glace.
   3. Préparez à l’avance les solutions suivantes jusqu’à des concentrations de stock de 1 M dans de l’eau de biologie moléculaire. Ajouter (en mL) : 2,32 K-gluconate, 0,24 Na-gluconate, 0,20 HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique), 0,16 KCl, 0,05_K-2-EGTA (éthylène glycol-bis(éther β-aminoéthylique)-N,N,N′,N′-acide tétraacétique), 0,04 MgCl2 dans le tube de 50 mL.
   4. Ajouter 100 μL de 0,3 M Na₃GTP (sel de sodium de guanosine 5′-triphosphate)
   5. Peser 44,08 mg de K2 ATP (sel dipotassique d’adénosine 5′-triphosphate) dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et ajouter 1 mL d’eau de biologie moléculaire, puis ajouter dans un tube de 50 mL.
   6. Ajustez le pH à 7,2-7,4 avec 1 M KOH. Assurez-vous que l’osmolarité est comprise entre 283 et 289 mOsm.

2. Préparation des tranches

1. Préparer les outils
   1. Ajoutez 200 mL d’aCSF dans la chambre de récupération (construite à partir d’un bécher de 250 mL avec 4 puits et un filet) et placez la chambre de récupération dans un bain-marie (35 °C).
   2. Couvrez la chambre d’un film de paraffine et faites constamment bouillonner l’aCSF avec 95 % O2/5 % CO2 à l’aide d’un tube à dispersion en verre pendant au moins 20 min.
   3. Installez les outils de dissection (scalpel, ciseaux fins coudés, pinces, pinceau fin, cuillère en plastique).
   4. Remplissez une seringue de 60 mL avec environ 15 mL de la solution de tranchage glacée de l’étape 1.1.4.
   5. Préparez la plate-forme de dissection en plaçant du papier filtre sur le couvercle d’une plaque de puits.
   6. Préparez la chambre à trancher en la plaçant dans le bac à glaçons et en remplissant le bac de glaçons.
   7. Configurez le vibratome en fixant une lame jetable dans le porte-lame.
   8. Pour fabriquer une pipette de transfert, cassez la pointe d’une pipette Pasteur et placez une poire en caoutchouc sur l’extrémité cassée.
2. Disséquer le cerveau de la souris
   1. Anesthésier l’animal dans une chambre saturée d’isoflurane à 4 % jusqu’à ce que les réflexes spinaux disparaissent.
   2. Décapitez l’animal à l’aide d’une guillotine et retirez rapidement la cervelle.
      1. Faites une incision médiane avec une lame de scalpel n° 22 du rostral au caudal.
      2. Latéralement, pelez le cuir chevelu de chaque côté de la tête.
      3. Utilisez des ciseaux fins pour couper le crâne d’un côté de la caudale au rostral (y compris le côté des os frontaux), en prenant soin de ne pas endommager le cerveau.
      4. À l’aide d’une pince, soulevez le morceau de crâne du cerveau et refroidissez rapidement le cerveau avec 15 ml de solution de tranchage glacée à l’aide de la seringue de l’étape 2.1.4.
      5. Soulevez le cerveau du crâne.
      6. Placez le cerveau dans l’un des béchers remplis d’une solution de tranchage glacée (à partir de l’étape 1.1.4) remplie de 95 % d’O2/5 % de CO2.

3. Préparez des tranches d’hypothalamus de souris.

1. Bloquez le cerveau pour la zone cérébrale et l’angle de coupe souhaités (par exemple, pour les coupes hypothalamiques coronales, coupez le tissu rostral au chiasma optique et caudal au pont à l’aide d’une lame et assurez-vous que le bloc caudal a une surface plane perpendiculaire à la base du cerveau).
2. À l’aide d’un morceau de papier filtre coupé, ramassez le cerveau du côté antérieur et collez le côté postérieur sur la plaque de maintien à l’aide de colle instantanée.
3. Placez rapidement la plaque de maintien dans la chambre de tranchage et remplissez-la avec la solution de tranchage du deuxième bécher à l’étape 1.1.4.
4. Fixez la chambre de tranchage et le bac à glaçons sur le vibratome.
5. Définissez la zone de tranchage (antérieure et postérieure au cerveau) et commencez à trancher des tranches coronales de 250 μm d’épaisseur. Paramètres recommandés : vitesse 0,10 mm/s, amplitude 2 mm.
6. Coupez les tranches à la taille appropriée pour la zone cérébrale souhaitée.
7. Récupérez les tranches à 35 °C pendant 30-45 min. Ensuite, retirez la chambre de récupération du bain chauffant et laissez les tranches récupérer à température ambiante pendant 30 minutes supplémentaires. Gardez les tranches à température ambiante pour le reste de la journée et continuez à faire bouillir le bain constamment avec 95 % O2/5 % CO2.

3. Patch ClampEnregistrement de cellules entières

1. Tirez sur les pipettes du patch.​
   1. À l’aide des paramètres suggérés pour l’enregistrement sur l’ensemble de la cellule dans le manuel de l’extracteur de pipettes, tirez les pipettes patch du verre à paroi épaisse jusqu’à une résistance de pipette de 3 à 5 MΩ.
   2. À l’aide d’une microseringue (commerciale ou artisanale), remplissez une pointe de pipette avec une solution interne filtrée. Pour fabriquer une micro-seringue, brûlez l’extrémité d’une seringue de 1 ml et laissez tomber l’embout, créant ainsi un embout long et fin.
2. Obtenez la configuration de la cellule entière.
   1. Placez la pipette d’enregistrement juste au-dessus de la tranche et décalez le courant de la pipette en mode pince de tension. Appliquez une légère pression positive sur la pipette et verrouillez le robinet d’arrêt.
   2. Sélectionnez une cellule saine avec une membrane intacte et approchez-la avec la pipette. La pression positive doit provoquer une légère perturbation dans les tissus (c’est-à-dire une onde lente dans les tissus lors de l’entrée).
   3. Continuez lentement à rapprocher la pipette de la cellule en effectuant un mouvement diagonal jusqu’à ce que la pipette forme une petite fossette à la surface de la cellule.
   4. Relâchez le verrou de pression positive. La cellule commencera à former un joint et la résistance augmentera au-dessus de 1 GΩ. Dans la pince de tension, maintenez la cellule à -68 mV.
   5. Éloignez-vous légèrement de la cellule en diagonale pour éliminer l’excès de pression de la cellule.
   6. Compensez la capacité rapide et lente de la pipette.
   7. Appliquez une brève aspiration à travers le tube relié au porte-pipette pour percer la cellule et obtenir une configuration de cellule entière.
   8. Passez en mode Cellule sur la fenêtre de test de la membrane dans un logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie (par exemple, Clampex).
   9. Avant chaque enregistrement de pince de tension, effectuez un test de membrane à l’aide du même logiciel et enregistrez les paramètres pertinents dans un livre de laboratoire (résistance de la membrane, résistance d’accès et capacité).
   10. Maintenir la température du bain d’enregistrement à 27-30 °C et le débit à 1,5-2,0 mL/min pour les expériences ultérieures.

Tableau 1 : La composition des différentes solutions.

	Concentrations en solution (mM)
	Trancher	LCRa normal	Faible teneur en Ca2+ aCSF	Sr+ aCSF	Pipette/Interne
NaCl	87	126	126	126	-
Kcl	2.5	2.5	2.5	2.5	8
CaCl2	0,5	2.5	0,5	-	-
SrCl2	-	-	-	2.5	-
MgCl2	7	1.5	2.5	1.5	deux
NaH2PO4	1,25	1,25	1,25	1,25	-
NaHCO3	25	26	26	26	-
glucose	25	10	10	10	-
saccharose	75	-	-	-	-
K-gluconate	-	-	-	-	116
Na-gluconate	-	-	-	-	12
HEPES	-	-	-	-	10
K2-EGTA	-	-	-	-	1
K2ATP	-	-	-	-	4
Na3GTP	-	-	-	-	0,3

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de 1 ml	Bd	309659
10 lames	Fisher Scientific/autres	Référence 35698
22 lames	VWR/autres	Référence 21909-626
22 uM filtres à seringue	Le milipore	Tél. : 09-719-000
Adson foreceps	Instruments de Harvard	Référence 72-8547
Ciseaux tranchants coudés	Instruments de Harvard	Référence 72-8437
Clampex	Dispositifs moléculaires	Pince 10
Lame à double tranchant	VWR	Référence 74-0002
Papier filtre	Sigma/autres	1001090
Pinceau fin	Fisher/divers	15-183-35/divers
Tube de dispersion de gaz	VWR	LG-8680-120
L’isoflurane	Fresenius Kabi/autres	Référence M60303
Colle Krazy	divers	divers
Mini analyse	Synaptosoft	Mini-Analyse 6
Osmomoter	Wescor Inc	Modèle 5600
Parafilm	sigma	Réf. PM-996
Pipette Pasteur	VWR	Référence 14672-200
Ph-mètre	Mettler Toledo	FE20-ATC
Ampoule en caoutchouc	VWR	Référence 82024-550
Manche de scalpel n° 3	Instruments de Harvard	Référence 72-8350
Manche de scalpel n° 4	Instruments de Harvard	Référence 72-8356
Lame à tranchant unique	VWR	Référence 55411-050
Trancheuse Vibratome	Leica	VT1200S
Système de purification de l’eau	Millipore	Milli-Q Académique A10
Couvercle à plaque de puits	Fisher/divers	07-201-590/divers
CaCl2 2H2O	sigma	Réf. C7902
CdCl2	sigma	202908
EGTA	sigma	E3889
glucose	sigma	Référence G5767
HEPES	sigma	N° H3375
K2-ATP	sigma	A8937
Kcl	sigma	P9333
K-gluconate	sigma	G4500
MgCl2 6H2O	sigma	M2670
Eau de qualité biologie moléculaire	sigma	W4502-1L
Na3GTP	sigma	Référence G8877
NaCl	Boutique bio	Référence : SOD001.1
Na-gluconate	sigma	S2054
NaH2PO4	sigma	Référence 71504
NaHCO3	sigma	S6014
Picrotoxine	sigma	P1675
SrCl	sigma	255521
saccharose	Boutique bio	SUC507.1