Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. pHuC_Mermaid Génération de plasmides
REMARQUE : Mermaid est un biocapteur développé en appariant le domaine de détection de tension (VSD) du capteur de tension Ciona intestinalis (maintenant Ciona robusta) contenant de la phosphatase (Ci-VSP) avec les fluorophores partenaires de transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET) Umi-Kinoko Green (mUKG : donneur) et une version monomère de la protéine fluorescente émettrice d’orange Kusabira Orange (mKOk : accepteur). Pour ce biocapteur, les changements conformationnels du domaine VSD, induits par la dépolarisation membranaire, augmentent la proximité des protéines fluorescentes donneuses et accepteuses, augmentant ainsi le transfert d’énergie entre elles (augmentant le rapport FRET). Le VSD assure la localisation efficace du biocapteur au niveau de la membrane plasmique. L’expression neuronale du biocapteur (dans la moelle épinière, le signal est détectable à la fois dans les interneurones et les motoneurones) est obtenue par clonage du cadre de lecture ouvert Sirène (ORF) sous le promoteur pan-neural HuC du poisson zèbre.
- Amplifier par réaction en chaîne par polymérase (PCR) le cadre de lecture ouvert (ORF) de la Sirène du plasmide pCS4+ avec ADN polymérase Pfu (relecture) à l’aide de l’amorce universelle T3 et de l’amorce Mermaid SmaI (5′TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA) afin d’insérer un site de restriction SmaI en amont de l’ORF Sirène.
- Utilisez le mélange PCR suivant : 0,5 μL d’ADN polymérase Pfu, 7,5 μL du tampon spécifique 10x, 1 μL de 10 mM de désoxynucléotides triphosphates (dNTP), 2,5 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO), 0,5 μL (50 ng) de la préparation plasmidique et 1 μL de solutions mères 20-μM de chaque amorce dans un volume total de 50 μL.
- Chauffer le mélange PCR pendant 15 s à 95 °C, l’amorcer pendant 15 s à 50 °C et l’allonger pendant 4 min à 72 °C pour un total de 35 cycles.
- Purifiez le produit PCR contondant spécifique à l'aide d'un kit de purification de gel commercial, en suivant le protocole du fabricant.
- Clonez le fragment d'ADN dans le vecteur contondant pCMV-SC en suivant le protocole du fabricant.
- Linéariser le plasmide positif à la sirène (nommé pCMV-SC_Mermaid) avec l’enzyme de restriction SmaI pour l’insertion suivante du promoteur HuC.
- Configurez la réaction de restriction comme suit : 0,5 μL (10 U) d’enzyme de restriction SmaI, 2 μL du kit 10x tampon et 5 μg d’ADN plasmidique dans un volume total de 20 μL. Incuber la réaction à 25 °C pendant 1 h.
- Purifiez le plasmide digéré à l'aide d'un kit de purification de gel commercial en suivant le protocole du fabricant.
- Amplifier par PCR le promoteur HuC (pHuC), avec l’ADN polymérase Pfu et l’ADN génomique du poisson-zèbre comme matrice, en utilisant une paire d’amorces spécifiques au HuC (HuCprom-forw1_SalI : 5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA et HuCprom-rev1 : 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) et couvrant une région de 3 150 pb en amont de l’ATG.
- Configurez le mélange PCR à l’aide du schéma suivant : 0,5 μL d’ADN polymérase Pfu, 7,5 μL du tampon spécifique 10x, 1 μL de 10 mM de dNTPs, 2,5 μL de DMSO, 200 ng d’ADN génomique et 1 μL de solutions mères de 20 μM de chaque amorce dans un volume total de 50 μL.
- Après une première étape de 2 min à 95 °C, chauffez le mélange PCR pendant 15 s à 95 °C, amorcez-le pendant 15 s à 50 °C et allongez-le pendant 4 min à 72 °C pour un total de 35 cycles.
- Purifiez le produit PCR contondant spécifique à l'aide d'un kit de purification de gel commercial en suivant le protocole du fabricant.
- Comparez une quantité équimolaire du pCMV-SC_Mermaid purifié (étape 1.5) et de l’ADN pHuC (étape 1.7) à l’aide de 1 μL d’ADN ligase T4 et de 1 μL du tampon spécifique 10X dans un volume total de 10 μL. Incuber la réaction pendant 16 h à 4 °C.
- Transformer une aliquote de cellules compétentes avec 5 μL de la réaction de ligature (étape 1.8) en suivant les instructions du fabricant.
- Sélectionner les clones positifs au pHuC (pHuC_Mermaid) avec le promoteur inséré dans la bonne orientation par une double digestion Sal I-EcoRV (le site de restriction SalI a été inséré en amont du fragment promoteur à l’étape 1.6, tandis que le site de restriction EcoRV est positionné en aval de la région de polyadénylation, PolyA, du plasmide pCMV-SC).
- Configurez la réaction de restriction comme suit : 0,5 μL (10 U) des enzymes de restriction SalI et EcoRV, 2 μL du tampon kit10X et 1 μg d’ADN pHuC_Mermaid dans un volume total de 20 μL. Incuber la réaction à 37 °C pendant 1 h. Exécuter les réactions sur un gel d’agarose.
2. Microinjection d’embryons
- Transférez les œufs fécondés obtenus à partir de poissons-zèbres adultes de type sauvage (souche AB) ou Sod1-G93R dans une boîte de Pétri de 10 mm à l’aide d’une pipette en plastique.
- Rincez les embryons à l’eau froide (4 °C) et micro-injectez-les immédiatement dans le jaune avec 200 pg de pHuC_Mermaid plasmide à l’aide d’un micro-injecteur (pour une description globale et détaillée de la procédure de micro-injection).
- À l’aide d’une pipette en plastique, transférez les embryons dans une boîte de Pétri et incubez-les dans de l’eau de poisson à 28 °C jusqu’à ce qu’ils atteignent le stade de développement souhaité (20-24 h après la fécondation, hpf) pour les analyses suivantes.
3. Analyse spontanée de l’enroulement de la queue
REMARQUE : Évaluer le comportement spontané de l’enroulement de la queue chez des embryons de 20 à 24 hpf avec ou sans le médicament riluzole.
- Transférez un embryon dans une boîte de Pétri ronde de 90 mm remplie d'eau de poisson contenant 0,2 % de DMSO (véhicule du riluzole) et déchiffrez-le manuellement à l'aide de deux pinces de bijoutier à pointes acérées. Incuber l’embryon pendant 5 min.
- Détectez l’enroulement de la queue à température ambiante (RT) lors d’un enregistrement vidéo de 1 min à l’aide d’un appareil photo numérique monté sur un stéréomicroscope. Acquérir des séries chronologiques à une résolution temporelle de 30 images/s.
- Calculez la fréquence des enroulements spontanés de la queue en comptant le nombre de courbures (controlatérales et ipsilatérales) par unité de temps.
- Pour évaluer l’effet du médicament riluzole, utilisez délicatement une pipette Pasteur en plastique pour transférer l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri de 90 mm remplie d’eau de poisson contenant 5 μM de riluzole.
- Incuber l’embryon pendant 5 minutes avant d’enregistrer une vidéo de 1 minute et d’effectuer l’analyse comportementale comme ci-dessus.
4. Configuration d’imagerie pour la visualisation du biocapteur de sirène dans des embryons vivants : détection simultanée des signaux du donneur et de l’accepteur
- Montez les embryons de 20 à 24 hpf dans de l’agarose à 1 % à bas point de fusion dans de l’eau de poisson à 37 °C à l’intérieur d’une boîte d’imagerie à fond de verre de 35 mm. Orientez les embryons sur leurs côtés. Attendez que l’agarose se solidifie à température ambiante.
- Transférez la parabole d’imagerie sur la platine d’un confocal inversé monté sur un microscope inversé. Identifiez les motoneurones exprimant le biocapteur avec un objectif 20X (ouverture numérique de 0,7, NA) en excitant le mUKG avec la raie laser à argon de 488 nm et en enregistrant son émission entre 495 et 525 nm.
- Pour une mesure FRET, excitez mUKG, le donneur de la paire FRET, avec la ligne laser 488 nm. Détecter simultanément, avec un scanner résonant fonctionnant à 8 000 Hz en mode bidirectionnel, la fluorescence émise par le donneur (entre 495 et 525 nm) et la fluorescence émise par l’accepteur mKOk (entre 550 et 650 nm, canal FRET). Si disponible, utilisez le laser.
de 473 nm
note: L’efficacité d’excitation du donneur sera légèrement réduite (85 % au lieu de 93 % avec 488 nm), mais l’excitation croisée de l’accepteur sera également réduite (de 17 % avec la ligne laser 488 nm à 9 % avec la ligne laser 473 nm).
- Pour réduire la phototoxicité et le blanchiment des fluorophores, minimisez l’éclairage de l’échantillon en réduisant la puissance de la ligne laser (sur la fenêtre du trajet du faisceau du logiciel d’acquisition).
- Optimisez l’excitation pour qu’elle corresponde aux paramètres de gain et de décalage définis au début de l’expérience et maintenus constants tout au long de la session. Pour régler le décalage, changez la couleur de l’image en valeurs d’intensité (à l’aide de la table de correspondance Q) et, pendant le balayage avec le laser éteint, tournez le bouton de décalage (décalage intelligent) de sorte que les pixels d’arrière-plan aient une intensité légèrement supérieure à zéro. Avec la même table de recherche, en allumant le laser pendant le balayage, tournez le bouton de gain (gain intelligent) pour maximiser le rapport signal/bruit, en prenant soin d’éviter les pixels saturés.
- À l’aide d’un sténopé ouvert (2 unités aérées), acquérez des images 16 bits pour fournir une plage dynamique suffisante pour les analyses quantitatives. Évitez le calcul de la moyenne pour augmenter la vitesse d’acquisition et minimiser le photoblanchiment.
- Dans la fenêtre d’acquisition de logiciels, sélectionnez une taille de champ d’image de 512 x 64 pixels (taille de pixel : 605 nm) dans le menu déroulant.
- Dans la fenêtre du mode d’acquisition, sélectionnez xyt (time lapse on a single xy plane) dansle menu déroulant et enregistrez les changements de tension des neurones spinaux embryonnaires en acquérant un seul plan xy, en réglant les paramètres d’acquisition pour enregistrer une image toutes les 30 ms pendant 1 min.
- Pour évaluer l’effet de l’administration de riluzole sur la dépolarisation membranaire dans le même neurone, acquérir un nouvel ensemble de données 5 min après l’ajout d’eau de poisson contenant 5 μM de riluzole.
- Pour l’analyse FRET, utilisez la macro ImageJ Biosensor_FRET (exprimant des biocapteurs FRET à chaîne unique).
- Évaluez le rapport FRET de la membrane basale de chaque neurone à t1 comme suit : ((Moyenne FRET - Arrière-plan FRET)/(Moyenne donneuse - Arrière-plan donneur)), où FRET et Intensité moyenne donneur est l’intensité moyenne de fluorescence calculée dans la même région d’intérêt (ROI) dessinée autour de la cellule pour chaque canal acquis et FRET et Arrière-plan donneur sont l’intensité moyenne de fluorescence calculée dans un ROI du champ de vision sans l’échantillon fluorescent.
note: Une description détaillée étape par étape de l’utilisation du plugin se trouve sur le site Web de www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret.
- Utilisez un logiciel de représentation graphique pour comparer la fréquence, l’amplitude et la durée de la dépolarisation entre différents paradigmes expérimentaux. Comparez deux groupes à l'aide d'un test t de Student non apparié et considérez les valeurs moyennes comme statistiquement différentes lorsque P <0,05.
