Enregistrement électrophysiologique des réponses en tension des photorécepteurs rétiniens de la drosophile à des stimuli lumineux

Résumé

Source : Juusola, M., et al. Méthode électrophysiologique pour l’enregistrement des réponses en tension intracellulaire des photorécepteurs et des interneurones de la drosophile à des stimuli lumineux in vivo. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo décrit le protocole d’enregistrement électrophysiologique de l’activité des photorécepteurs dans l’œil d’une drosophile immobilisée, permettant une mesure précise des changements de tension en réponse à des stimuli lumineux.

Protocole

1. Enregistrement à partir des photorécepteurs R1-R6

1. Soyez toujours mis à la terre lorsque vous utilisez l’amplificateur à microélectrodes (par exemple en touchant la surface métallique de la cage de Faraday ou de la table antivibratoire), car cela empêche de délivrer accidentellement une charge statique à l’étage de tête, ce qui pourrait endommager les circuits.
2. Éclairez le poteau de la plate-forme de préparation des mouches par le haut à l’aide de deux guides de lumière en col de cygne (figure 1A) (avec la source de lumière froide à l’intérieur de la cage de Faraday) de sorte que le porte-mouche puisse être placé sur le poteau dans la position préférée sous un contrôle visuel étroit.
3. Montez le porte-mouche (avec la mouche dedans !) sur le poteau de la plate-forme de préparation des mouches. Faites pivoter le porte-mouche de sorte que l'œil gauche de la mouche soit directement face à l'enquêteur (Figure 1B).
4. Insérez doucement l'électrode de référence émoussée à travers les ocelles de la mouche dans la capsule céphalique à l'aide d'un petit micromanipulateur grossier tout en observant la préparation au stéréomicroscope (figure 1C). N’enfoncez pas l’électrode trop profondément, car cela pourrait endommager le cerveau de la mouche.
   1. Vous pouvez également insérer l’électrode de référence à l’arrière du thorax. Assurez-vous toujours que la mouche semble en bonne santé (bouge ses antennes) et que ses yeux sont intacts et non endommagés accidentellement. Si la préparation ne semble pas immaculée, préparez une nouvelle mouche pour les expériences.
5. Enfoncez la microélectrode d’enregistrement pointue dans l’œil gauche à travers une petite ouverture recouverte de vaseline. Utilisez un grossissement élevé dans le stéréomicroscope et déplacez les guides de lumière et le plan focal de sorte que l’emplacement de l’extrémité de l’électrode devienne apparent en 3D par ses motifs de réflectance.
   REMARQUE : La figure 1D montre comment la tête de la mouche doit être positionnée (par rapport à l'angle auquel la microélectrode d'enregistrement pénètre dans l'œil) pour l'enregistrement des photorécepteurs. Enfoncer l’électrode dans l’œil sans la casser est la phase la plus difficile de l’expérience. Si l’extrémité de l’électrode manque la petite ouverture de l’œil, frappant la cornée, elle se brise généralement.
6. Allumez l'amplificateur de microélectrodes une fois que les deux électrodes sont fermement à l'intérieur de la préparation, en contact électrique avec les fluides corporels de la mouche.
7. Éteignez la source de lumière froide (à l’intérieur de la cage de Faraday) et débranchez-la du secteur. Connectez sa prise à la terre centrale pour minimiser le bruit électrique induit par la boucle de terre et éloignez les guides de lumière en col de cygne afin que le système de bras à cardan puisse être déplacé librement autour de la mouche. Éteignez les lumières de la pièce pour vous assurer que la préparation des mouches est maintenant dans une obscurité relative.
8. Mesurez la résistance de l’électrode d’enregistrement dans l’œil. N’utilisez que des électrodes enregistreuses dont la résistance est comprise entre 100 et 250 MΩ.
   note: Il est pratiquement impossible d’obtenir des enregistrements intracellulaires de haute qualité avec une électrode de <70 MΩ. Si la résistance est de <80 MΩ, il est probable que la pointe de l’électrode soit cassée. Dans ce cas, éteignez l’amplificateur et changez l’électrode d’enregistrement.
9. Réglez l’amplificateur sur le mode d’enregistrement par pince de courant (CC) ou pont. Annulez toute différence de tension arbitraire entre les électrodes d’enregistrement et de référence, car les deux reposent maintenant dans l’espace extracellulaire électriquement interconnecté, en réglant le décalage du signal (tension d’enregistrement) à zéro. Suivez les changements de décalage du signal à l'aide de l'affichage de l'amplificateur ou de l'écran d'un oscilloscope.
10. Attendez 2-3 min pour que l’œil de la mouche s’adapte à l’obscurité.
11. Enfoncez la pointe de l’électrode d’enregistrement plus profondément dans l’œil à l’aide de petits pas de 0,1 à 1 micron. Pour ce faire, à l’aide d’un piézo-pas sur l’axe X d’un micromanipulateur télécommandé ou en tournant doucement le bouton de résolution fine d’un manipulateur manuel.
12. Stimulez l’œil de la mouche avec des clignotements lumineux brefs (1 à 10 ms) lorsque l’électrode d’enregistrement avance dans le tissu.
    note: Si l’électrode d’enregistrement est positionnée dans la rétine et que l’œil fonctionne normalement, chaque flash lumineux provoquera une brève et petite chute de tension (hyperpolarisation de 0,2 à 5 mV), appelée électrorétinogramme (ERG). Cette modification du potentiel de champ de l'espace extracellulaire est causée par la réponse collective des cellules rétiniennes à la lumière.

Résultats

Graphique 1. Positionnement du porte-mouche et des électrodes pour les expériences. (A-B) Le porte-mouche est placé sur la plate-forme d’enregistrement qui permet également le contrôle de la température via un élément Peltier (A : plate-forme ronde blanche au centre). Le bras à cardan permet un positionnement exact du stimulus lumineux à une distance égale (via une rotation x,y) autour de la m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope stéréo à zoom pour la préparation de la mouche	Olympe	Oculaires SZX12 DFPLFL1.6x PF : WHN30x-H/22	Capable d’un grossissement de ~150X avec une longue distance de travail ; support de table en acier lourd sur mesure
Stéréomicroscope dans le dispositif intracellulaire	· Olympe	Olympus SZX7 ; oculaires : WHN30x-H/22	Des oculaires 30X sont nécessaires pour bien voir les réflexions de la pointe de l’électrode lors de son passage à travers le petit trou cornéen dans l’œil
Microscope Nikon	Nikon SMZ645 ; oculaires : C- W30x/7
Table anti-vibration	Melles Griot	Avec trous métriques M6 sur la plaque d’essai	Nos plates-formes sur mesure ont un grand trou percé dans l’épaisse planche à pain qui laisse entrer le poteau de la plate-forme de préparation des mouches (abrite un dissipateur thermique en cuivre avec électronique) par le bas
Newport
Micromanipulateurs	Narishige	Narishige NMN-21	Dans nos installations intracellulaires, différents systèmes de micromanipulateurs sont utilisés pour enfoncer les électrodes d’enregistrement Shap dans l’œil de la mouche. Tous les manipulateurs répertoriés fournissent avec succès des enregistrements stables et durables à partir des photorécepteurs et des LMC de la drosophile.
Huxley Bertram	Axe xyz Huxley avec contrôle manuel précis
Sensapex	Sensapex triple axe
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K avec moteur piézoélectrique supplémentaire sur l’axe X et contrôleur MS 314
Supports magnétiques	N’importe quelle base magnétique avec interrupteur marche/arrêt fera l’affaire		Par exemple, pour gérer les câbles à l’intérieur de la cage de Faraday
Porte-électrodes	Appareil de Harvard	ESP/W-F10N
Fil d’argent	Instruments de précision mondiaux	AGW1510	Diamètre de 0,3 à 0,5 mm ; doit être chlorisé pour les porte-électrodes
Source lumineuse à fibre optique	Beaucoup de différents, y compris Olympus
Faisceaux de fibres optiques	Technologie UltraFine		Pour fournir le stimulus lumineux LED au système de bras à cardan. Nous utilisons des guides de lumière liquides et en quartz (allant de l’UV à l’IR)
Laboratoires Thorn
Tube de Catering Fly		P80-50P 50ml Cent. Tube PP., paquet de 100 pièces	Coupez le fond conique du tube à centrifuger en plastique de 50 ml et collez-y une pointe de pipette de 1 ml.
Système d’acquisition numérique	National Instruments
Amplificateur à microélectrodes à pince courant/tension à électrode unique	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ produits/amplificateurs/sec-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	Performant !
Scène de tête	Standard (+/- 150 nA)	Pour npi SEC-10LX
Sources lumineuses et pilotes LED	OptoLED 2 canaux (Cairn Research Ltd., Royaume-Uni)		Bon nombre de nos systèmes de relance sont fabriqués en interne
Auto-conçu et construit
Logiciels d’acquisition et d’analyses	De nombreuses entreprises parmi lesquelles choisir		Biosyst ; système basé sur Matlab écrit sur mesure pour le travail expérimental et théorique dans le laboratoire Juusola
Ordinateur personnel ou Mac			Assurez-vous que le PC ou le Mac est compatible avec le système et le logiciel d’acquisition de données
Système de bras à cardan	Auto-conçu et construit		Positionnement précis des stimuli lumineux
Système de contrôle de la température Peltier	Auto-conçu et construit
Cage de Faraday	Auto-construit		Blindage contre le bruit électromagnétique
Capillaires en verre borosilicaté filamenté		Diamètre extérieur : 1 mm
Diamètre intérieur : 0,5 - 0,7 mm
Capillaires en verre de quartz filamenté		Diamètre extérieur : 1 mm
Diamètre intérieur : 0,5 - 0,7 mm
Extracteur de pipette	Sutter Instrument Company	Modèle P-2000 laser Flaming/Brown Micropipette Puller	Pour les électrodes de référence en borosilicate, utilisez le programme prédéfini #11 (électrodes de patch) : Chaleur = 350 ; Filament = 4 ; Vitesse 36 ; Delay = 200).1.2.1). Pour les électrodes d’enregistrement en borosilicate, utilisez le programme prédéfini #12 (cela permet généralement d’obtenir de bons pointus conventionnels pour les enregistrements de photorécepteurs) : Chaleur = 355 ; Filament = 4 ; Vélocité 50 ; Retard = 225 ; Traction = 150. Pour les enregistrements LMC, qui nécessitent des électrodes avec des pointes plus fines, ces valeurs doivent être ajustées. Pour tirer des capillaires en quartz, le manuel P-2000 suggère des programmes pour Microélectrodes à pointe fine. Les paramètres prédéfinis de ces programmes servent de points de départ utiles pour des modifications systématiques afin de générer des électrodes avec un bon succès de pénétration et un faible bruit d’enregistrement.
Solution de sonnerie extracellulaire pour l’électrode de référence	Produits chimiques de Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, saccharose	Voir la recette dans la section protocole
Solution KCl 3 M pour le remplissage de la microélectrode d’enregistrement filamentée	Sels de Fisher Scientific	10010310, KCl
vaseline	Vaseline