Surveillance des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre immobilisée

Résumé

Source : Lunsford, E. T., et al. Activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure pendant la nage chez le poisson zèbre. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre l’enregistrement des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre paralysée en positionnant une micropipette près du ganglion de la ligne latérale et en formant un joint lâche pour la capture du signal. La solution extracellulaire maintient la viabilité neuronale pendant ce processus.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation du matériel pour les enregistrements électrophysiologiques

1. Fabriquez un plat d’enregistrement à fond en élastomère de silicone.
   1. Versez une fine couche de composants d’élastomère de silicone auto-mélangeant (par exemple, Sylgard) dans une boîte de culture tissulaire à fond de verre jusqu’à ce qu’elle soit au niveau du bord d’un puits peu profond. Environ 0,5 mL suffit.
   2. Couvrir et faire durcir le plat pendan....

Résultats

Figure 1 : Enregistrement électrophysiologique simultané de l’activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure et de la racine motrice ventrale. (A). Exemple d’électrodes d’enregistrement afférentes (i) et de racine motrice ventrale (ii) à patch lâche. Les barres d’échelle représentent 50 μm. (B) Les larves de .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bécher de 100 mL	Pyrex	1000	Réceptacle pour mordançage
Objectif d’immersion dans l’eau 10x	Olympe	UMPLFLN10xW	Faible grossissement pour le positionnement des larves et l’électrode d’enregistrement
Objectif d’immersion dans l’eau 40x	Olympe	LUMPLFLN40XW	Grossissement plus élevé pour la position de la pointe de l’électrode et l’établissement d’un patch-clamp
Câbles coaxiaux BNC	ThorLabs	Référence 2249-C-12	Connexion des canaux de l’amplificateur et du numériseur ; nécessite 4
Capillaires en verre borosilicaté avec filament	Warner Instruments	G150F-3	Diamètre intérieur : 0,86, diamètre extérieur : 1,50 ; verre capillaire utilisé pour former des électrodes d’enregistrement
ordinateur	n/a	n/a	N’importe quel ordinateur devrait fonctionner
Alimentation DC	Tenma	Référence 72-420	Utilisé pour la gravure électrique des goupilles de dissection
Numériseur d’électrophysiologie	Axon Instruments, Dispositifs moléculaires	Axon DigiData 1440A	Permet l’acquisition des données de patch-clamp
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	Filament de boîte de 2,5 mm utilisé dans l’extracteur de micropipettes
Pinces fines	Outils scientifiques fins	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N° d’article 11295-10	Utilisé pour manipuler les larves et insérer des broches
Microscope DIC à platine fixe	Olympe	BX51WI	Microscope utilisé pour visualiser et établir des enregistrements par patch-clamp
Pointe de pipette flexible et effilée	Fisher Scientific	Tél. : 02-707-169	Les pointes flexibles permettent l’insertion dans l’électrode d’enregistrement pour distribuer une solution extracellulaire à la pointe
Antenne parabolique	World Precision Instruments Inc.	Réf. FD3510-100	Couvercle Plat à fond en verre Plat d’enregistrement
KimWipe	KimTech	Référence 34155	Lingette de travail utilisée pour évacuer l’excès de liquide des larves
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	Élastomère sylgard auto-mélangeant
Amplificateur à microélectrodes	Axon Instruments, Dispositifs moléculaires	MultiClamp 700B	Amplificateur patch clamp pour les enregistrements à deux canaux
Microforge	Narishige	MF-830 microforge	Pour polir l’électrode d’enregistrement
Unité de commande du micromanipulateur	Siskiyou	MC1000-eR/T	Coordinateur de cadran à 4 axes pour le contrôle du micromanipulateur
Extracteur de micropipette	Sutter Instrument Company	Flaming/Marron P-97	Pour l’intégration du verre capillaire dans les électrodes d’enregistrement
Unité de contrôle du microscope	Siskiyou	MC1000e	Positionne le microscope autour de la platine fixe et de la préparation
Micromanipulateur motorisé	Siskiyou	MX7600	Positionne la scène de tête et l’électrode d’enregistrement attachée pour l’enregistrement par pince patch
MultiClamp Commander	Dispositifs moléculaires	2.2.2	Téléchargeable depuis la page de téléchargement d’Axon MultiClamp 700B Commander
Table d’air optique	Société de Newport	VH3036W-OPT	Table d’isolation de la plaque d’essai pour microscope à flotteur et minimiser les vibrations pendant les enregistrements
pCLAMP	Dispositifs moléculaires	10.7.0	Téléchargeable à partir du logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie pCLAMP 10 d’Axon
Boîte de Petri	Faucon	35-3001	Utilisé pour immerger les larves dans des
Porte-pipette	Dispositifs moléculaires	1-HL-U	Tenez l’électrode d’enregistrement et connectez-vous à la tête
Transducteur pneumatique	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	Pour le contrôle de la pression interne de l’électrode d’enregistrement
Hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	Référence 221473-25G	Agent de gravure pour goupilles de dissection
Tubes en silicone	Tygon	Référence 14-169-1A	Tube pour connecter le transducteur pneumatique au porte-pipette
Stéréomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Utilisé pour visualiser les pointes des épingles et pendant la préparation des larves
Lame de rasoir à bord droit	Canope	Commandez chez amazon.com	Coupe le fil de tungstène lors de la fabrication des broches de dissection
seringue	Becton Dickinson Compoany	309602	Rempli de solution extracellulaire à injecter dans des électrodes d’enregistrement
Pipette de transfert	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Pipette à usage unique, non stérile, pour le transfert des larves
Méthanesulfonate de tricaïne	Syndel	Référence 12854	Anesthésique pharmaceutique utilisé pour euthanasier les larves à fort dosage.
Fil de tungstène	World Precision Instruments Inc.	Référence 715500	0,002 pouce, 50,8 μm de diamètre ; utilisé pour fabriquer des broches de dissection
Unité de filtration sous vide	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Unités de filtration sous vide stériles à usage unique utilisées pour stériliser la solution extracellulaire utilisée pour la sonnerie d’électrodes d’électrophysiologie
Tension à pince de courant	Dispositifs moléculaires	CV-7B	Livré avec l’amplificateur MultiClamp 700B utilisé comme étages supérieurs gauche et droit
α-bungarotoxine	ThermoFisher	Réf. B1601	Pour immobiliser les larves avant l’enregistrement