Surveillance des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre immobilisée

Résumé

Source : Lunsford, E. T., et al. Activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure pendant la nage chez le poisson zèbre. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre l’enregistrement des signaux électriques des neurones afférents chez une larve de poisson-zèbre paralysée en positionnant une micropipette près du ganglion de la ligne latérale et en formant un joint lâche pour la capture du signal. La solution extracellulaire maintient la viabilité neuronale pendant ce processus.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation du matériel pour les enregistrements électrophysiologiques

1. Fabriquez un plat d’enregistrement à fond en élastomère de silicone.
   1. Versez une fine couche de composants d’élastomère de silicone auto-mélangeant (par exemple, Sylgard) dans une boîte de culture tissulaire à fond de verre jusqu’à ce qu’elle soit au niveau du bord d’un puits peu profond. Environ 0,5 mL suffit.
   2. Couvrir et faire durcir le plat pendant au moins 48 h à température ambiante.
2. Faites des broches de dissection.
   1. À l’aide d’une alimentation CC, fournissez une charge négative (5 V) à un bécher de 100 ml de mordançant (3M KOH) et fixez un fil de tungstène (0,002 pouce ; 50,8 μm de diamètre) à la sortie chargée positivement.
      prudence: Les fils négatifs et positifs ne doivent pas entrer en contact l’un avec l’autre pendant cette procédure, car vous risquez de produire des étincelles, ce qui pourrait présenter un risque d’incendie.
   2. Gravez le fil de tungstène en trempant rapidement et à plusieurs reprises la pointe dans le bain de mordançage jusqu’à ce que la pointe se rétrécisse en une pointe acérée. Sous un stéréomicroscope, coupez le fil à environ 1 mm de la pointe avec une lame de rasoir à bord droit. Répétez l’opération trois fois de plus, puis insérez les broches dans la boîte d’enregistrement durcie à l’aide d’une pince fine.
3. Préparez les électrodes d’enregistrement.
   1. À l’aide d’un extracteur de micropipette horizontal avec filament en boîte, tirez un tube capillaire en verre borosilicaté (diamètre intérieur : 0,86 mm, diamètre extérieur : 1,50 mm) dans des électrodes avec une pointe de 30 μm de diamètre avec un léger cône (Figure 1 Ai) qui seront utilisées pour enregistrer les neurones afférents de la ligne latérale postérieure.
   2. Tirez un tube capillaire supplémentaire en verre borosilicaté dans une paire d’électrodes avec des diamètres d’embout plus petits (1-5 μm). En tenant une électrode dans chaque main, passez doucement les pointes l’une sur l’autre pour les casser à un angle de ~30°. À l’aide d’une microforge, polissez la pointe biseautée jusqu’à ce qu’elle soit lisse.
4. Générer le protocole dans des programmes d’enregistrement électrophysiologiques.
   1. Assurez-vous que l’étage de tête droit est connecté à l’entrée du canal 1 à l’arrière de l’amplificateur à pince de courant et de tension à microélectrode pour les enregistrements de neurones afférents.
      REMARQUE : les spécifications de l’ordinateur pour l’amplificateur à pince de courant et de tension nécessitent au minimum un processeur 1 Ghz ou supérieur, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, un lecteur de CD-ROM avec 512 Mo de RAM, 500 Mo d’espace sur le disque dur et 2 ports USB.
   2. Ouvrez le logiciel de l’amplificateur contrôlé par l’ordinateur.
   3. Réglez le canal 1 en mode de pince de courant en cliquant sur le bouton IC.
   4. Entrez le paramètre suivant sous l’onglet I-Clamp 1. Sortie primaire : 100x Potentiel de membrane AC (100 000 mV/mV), Gain : 1 000, Bessel : 1 kHz, AC : 300 Hz, Scope : Bypass. Sortie secondaire : 100x potentiel de membrane AC (100 mV/mV), gain : 1, filtre passe-bas : 10 Hz.
   5. Enregistrez le paramètre de canal sous la forme Ch1_Aff.
   6. Installez et ouvrez le logiciel d’électrophysiologie du patch clamp.
   7. Cliquez sur Configurer et sélectionnez Lab Bench pour configurer les signaux analogiques en ajoutant des Ch1_Aff aux canaux du numériseur (par exemple, Analog IN #0 et Analog IN #1) connectés par un câble coaxial BNC aux sorties mises à l'échelle du canal 1 correspondantes de l'amplificateur. Cliquez sur OK.
      REMARQUE : la configuration minimale requise pour le numériseur est la suivante : un processeur de 1 Ghz ou supérieur, Windows XP Pro ou Mac OS X 10.46.6, un lecteur de CD-ROM de 512 Mo de RAM, 500 Mo d’espace disque dur et 2 ports USB.
   8. Cliquez sur Acquérir et sélectionnez Nouveau protocole.
   9. Dans l’onglet Mode/Taux, sélectionnez Sans écart ; sous Mode d’acquisition, définissez la durée de l’essai sur Utiliser l’espace disque disponible (c’est-à-dire enregistrer jusqu’à l’arrêt) ou la durée souhaitée (hh :mm :ss), puis réglez le taux d’échantillonnage par signal (Hz) sur 20 000 pour maximiser la résolution.
   10. Sous l’onglet Entrées, sélectionnez les voies d’entrée analogiques précédemment configurées (à l’étape 1.4.6) et sélectionnez Ch1_Aff pour la voie correspondante.
   11. Sous l’onglet Sorties, sélectionnez Cmd 0 et Cmd 1 pour le canal #0 et le canal #1, respectivement.
       1. Connectez la commande du canal 1 de l’amplificateur à la sortie analogique 0 du numériseur via un câble coaxial BNC.
   12. Les onglets restants peuvent rester sous les paramètres par défaut. Cliquez sur OK et enregistrez le protocole.

2. Préparation de la solution

1. Préparez la solution de Hank : 137 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 0,25 mM de Na₂HPO₄, 0,44 mM de KH₂PO₄, 1,3 mM de CaCl₂, 1,0 mM de MgSO₄, 4,2 mM de NaHCO₄ ; pH de 7,3. Diluer à 10 % de la solution de Hank en ajoutant le volume approprié d'eau désionisée au stock.
2. Préparez la solution extracellulaire : 134 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,2 mM de MgCl₂, 2,1 mM de CaCl₂, 10 mM de glucose et 10 mM de tampon HEPES, pH de 7,8 ajusté avec du NaOH. Filtrez la solution extracellulaire sous vide à travers un filtre avec une taille de pores de 0,22 μm.
3. Préparez α-bungarotoxine : Dissoudre 1 mg de α-bungarotoxine lyophilisée dans une solution extracellulaire de 10 mL pour produire une dilution de 0,1 %.
4. Préparez une solution d'euthanasie : 50 % (mg/L) de MS-222 tamponné de qualité pharmaceutique dans une solution de Hank à 10 %.
   ATTENTION : α-bungarotoxine est une neurotoxine puissante qui paralyse les muscles en bloquant les récepteurs cholinergiques. Des gants sont obligatoires et une protection oculaire est recommandée lors de la manipulation du paralytique.

3. Préparation des larves pour les enregistrements électrophysiologiques

1. Immobiliser les larves de poisson-zèbre.
   1. Utiliser des larves de la population de poissons-zèbres élevés en laboratoire (Danio rerio ; 4 à 7 jours après la fécondation) et les loger dans une solution embryonnaire (solution de Hank à 10 %) à 27 °C.
   2. À l’aide d’une pipette de transfert à grande pointe, transférez la larve du boîtier dans une petite boîte de Pétri (35 mm) et retirez autant de solution environnante que possible.
      note: L’élimination de la solution embryonnaire empêche la dilution du paralytique et augmente son efficacité. Le coin d’une lingette de travail peut être utilisé pour évacuer la solution embryonnaire restante, et il est essentiel de ne pas entrer en contact avec les larves ou de les laisser exposées à l’air.
   3. Immerger les larves dans 10 μL de α-bungarotoxine à 0,1 % pendant environ 5 min
      note: Le temps nécessaire à l’immobilisation des larves varie d’une préparation à l’autre. Une préparation saine dépend d’une surveillance étroite et soutenue d’un flux sanguin rapide et d’une diminution des réponses motrices. Une brève surexposition au paralytique peut entraîner un lent déclin de la santé globale de la préparation, même après un lavage complet. Il est préférable d’appliquer un lavage avant que la larve ne soit complètement immobilisée alors qu’elle montre encore des signes de vibrations musculaires subtiles.
   4. Lavez la larve paralysée avec la solution extracellulaire et baignez-la pendant 10 min.
      note: Le lessivage permet à la larve de passer de vibrations musculaires subtiles à une paralysie complète. De plus, la α-bungarotoxine est un antagoniste de la sous-unité α9 du récepteur nicotinique de l’acétylcholine (nAChR), qui est un composant essentiel du circuit de rétroaction endogène observé par ce protocole ; cependant, il a été démontré que cet effet est réversible dans les cellules ciliées du xénope et du poisson-zèbre après un lavage de 10 minutes.
2. Épingler le poisson dans le plat d’enregistrement.
   note: L’anesthésie (p. ex., MS-222, tricaïne) n’est pas nécessaire lors de la préparation des larves de poisson-zèbre (4-7 dpf) car elle interfère avec la santé animale. En fait, les larves de poisson-zèbre sont exemptées de certains protocoles sur les vertébrés.
   1. À l’aide d’une pipette de transfert, déplacez la larve du bain de solution extracellulaire vers la boîte d’enregistrement à fond de silicone. Remplissez le reste de la boîte avec la solution extracellulaire.
   2. Sous un stéréomicroscope, positionnez doucement les larves à l'aide d'une pince à pointe fine au-dessus du centre du tapis de silicone, côté latéral vers le haut, les extrémités antérieure et postérieure du corps allant respectivement de gauche à droite. Saisissez ensuite une épingle gravée dans le tapis de silicone à l’aide d’une pince à pointe fine et insérez la goupille, orthogonalement au silicone, à travers la notocorde dorsale des larves directement dorsale à l’anus. Insérez la deuxième goupille dans la notocorde près de l’extrémité de la queue et insérez la troisième goupille dans la dorsale de la notocorde de la vessie à gaz (figure 1B).
      note: Lors de l’insertion des broches, il est important de cibler le centre de la largeur de la notocorde pour éviter d’entraver la circulation sanguine ou d’endommager la musculature environnante. La notocorde est dorsale par rapport au nerf de la ligne latérale postérieure, donc avec une épingle appropriée, aucun dommage n’est prévu aux neurones sensoriels de la ligne latérale. Insérer après le premier contact afin de ne pas perturber les tissus environnants. Idéalement, le diamètre de la goupille est inférieur à la moitié de la largeur de la notocorde pour assurer une insertion propre. Si les goupilles dépassent cette largeur, répétez l’étape 1.2 jusqu’à ce que la largeur de goupille souhaitée soit atteinte. Si le flux sanguin ralentit après l’épinglage, répétez l’opération à partir de l’étape 1.3 avec un nouvel échantillon.
   3. Insérez la quatrième goupille à travers la vésicule otique tout en effectuant une légère rotation vers l’avant pendant que la goupille s’insère dans l’encapsulant (figure 1B). Lorsqu’une légère rotation est appliquée, surveillez le tissu entre le cleithrum et la vésicule otique pour révéler l’amas de somates afférentes.
      note: L’insertion angulaire de la quatrième broche permet d’assurer l’exposition du ganglion afférent de la ligne latérale postérieure, qui est autrement obstrué par la grande vésicule otique.

4. Enregistrement des neurones afférents

1. Remplissez l’électrode d’enregistrement afférente avec 30 μL de solution extracellulaire, insérez-la dans le porte-pipette de l’étage supérieur droit (figures 1B, C) et abaissez-la dans la solution parabole tout en appliquant une pression positive (1 à 2 mm Hg) produite par un transducteur pneumatique.
2. Localisez et fixez-le lâchement à la ligne latérale postérieure du ganglion afférent.
   1. À l’aide d’un micromanipulateur, abaissez l’extrémité de l’électrode afférente jusqu’à ce qu’elle soit en position de maintien au-dessus du cléithrum.
   2. Augmentez le grossissement à 40x l’immersion et localisez l’intersection de la ligne latérale postérieure du nerf et du cleithrum. Suivez la ligne latérale nerveuse antérieure du cleithrum jusqu’à l’endroit où les fibres innervent le ganglion afférent de la ligne latérale postérieure, qui se distingue par le groupe discret de soma (Figure 1F).
   3. Amenez la pointe de l’électrode sur le ganglion afférent et abaissez la pipette jusqu’à ce que la pointe entre en contact avec l’épithélium. Doucement, manœuvrez l’électrode de manière à ce que toute la circonférence de la pointe entre en contact avec le ganglion afférent.
   4. Appliquez une pression négative (20-50 mm Hg) avec le transducteur pneumatique et maintenez.
      note: La pression négative appliquée sur le ganglion afférent est douce. L’augmentation de la pression négative peut améliorer le rapport signal/bruit, mais la santé des neurones afférents décline sous l’effet d’une aspiration agressive soutenue, ce qui diminue la probabilité d’un enregistrement réussi.
3. Enregistrez l’activité des neurones afférents.
   1. L’étage de tête gauche doit être connecté à l’amplificateur, qui relaie le signal amplifié dans un numériseur qui émet ledit signal dans le logiciel d’électrophysiologie du patch clamp pour être surveillé sur un ordinateur adjacent.
   2. Dans pClamp10, cliquez sur le bouton Lecture de la barre d’outils pour surveiller les neurones afférents.
   3. Assurez-vous que l’enregistrement de l’ensemble de la cellule, en patch lâche, des neurones afférents est réalisé une fois que les pics se produisent spontanément, environ toutes les 100 à 200 ms (Figure 1E).
   4. Progressivement, augmentez la pression de l’électrode d’enregistrement des neurones afférents à l’atmosphère (0 mm Hg) et maintenez-la pendant le reste de l’enregistrement.

Résultats

Figure 1 : Enregistrement électrophysiologique simultané de l’activité des neurones afférents de la ligne latérale postérieure et de la racine motrice ventrale. (A). Exemple d’électrodes d’enregistrement afférentes (i) et de racine motrice ventrale (ii) à patch lâche. Les barres d’échelle représentent 50 μm. (B) Les larves de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bécher de 100 mL	Pyrex	1000	Réceptacle pour mordançage
Objectif d’immersion dans l’eau 10x	Olympe	UMPLFLN10xW	Faible grossissement pour le positionnement des larves et l’électrode d’enregistrement
Objectif d’immersion dans l’eau 40x	Olympe	LUMPLFLN40XW	Grossissement plus élevé pour la position de la pointe de l’électrode et l’établissement d’un patch-clamp
Câbles coaxiaux BNC	ThorLabs	Référence 2249-C-12	Connexion des canaux de l’amplificateur et du numériseur ; nécessite 4
Capillaires en verre borosilicaté avec filament	Warner Instruments	G150F-3	Diamètre intérieur : 0,86, diamètre extérieur : 1,50 ; verre capillaire utilisé pour former des électrodes d’enregistrement
ordinateur	n/a	n/a	N’importe quel ordinateur devrait fonctionner
Alimentation DC	Tenma	Référence 72-420	Utilisé pour la gravure électrique des goupilles de dissection
Numériseur d’électrophysiologie	Axon Instruments, Dispositifs moléculaires	Axon DigiData 1440A	Permet l’acquisition des données de patch-clamp
filament	Sutter Instrument Company	FB255B	Filament de boîte de 2,5 mm utilisé dans l’extracteur de micropipettes
Pinces fines	Outils scientifiques fins	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N° d’article 11295-10	Utilisé pour manipuler les larves et insérer des broches
Microscope DIC à platine fixe	Olympe	BX51WI	Microscope utilisé pour visualiser et établir des enregistrements par patch-clamp
Pointe de pipette flexible et effilée	Fisher Scientific	Tél. : 02-707-169	Les pointes flexibles permettent l’insertion dans l’électrode d’enregistrement pour distribuer une solution extracellulaire à la pointe
Antenne parabolique	World Precision Instruments Inc.	Réf. FD3510-100	Couvercle Plat à fond en verre Plat d’enregistrement
KimWipe	KimTech	Référence 34155	Lingette de travail utilisée pour évacuer l’excès de liquide des larves
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	Élastomère sylgard auto-mélangeant
Amplificateur à microélectrodes	Axon Instruments, Dispositifs moléculaires	MultiClamp 700B	Amplificateur patch clamp pour les enregistrements à deux canaux
Microforge	Narishige	MF-830 microforge	Pour polir l’électrode d’enregistrement
Unité de commande du micromanipulateur	Siskiyou	MC1000-eR/T	Coordinateur de cadran à 4 axes pour le contrôle du micromanipulateur
Extracteur de micropipette	Sutter Instrument Company	Flaming/Marron P-97	Pour l’intégration du verre capillaire dans les électrodes d’enregistrement
Unité de contrôle du microscope	Siskiyou	MC1000e	Positionne le microscope autour de la platine fixe et de la préparation
Micromanipulateur motorisé	Siskiyou	MX7600	Positionne la scène de tête et l’électrode d’enregistrement attachée pour l’enregistrement par pince patch
MultiClamp Commander	Dispositifs moléculaires	2.2.2	Téléchargeable depuis la page de téléchargement d’Axon MultiClamp 700B Commander
Table d’air optique	Société de Newport	VH3036W-OPT	Table d’isolation de la plaque d’essai pour microscope à flotteur et minimiser les vibrations pendant les enregistrements
pCLAMP	Dispositifs moléculaires	10.7.0	Téléchargeable à partir du logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie pCLAMP 10 d’Axon
Boîte de Petri	Faucon	35-3001	Utilisé pour immerger les larves dans des
Porte-pipette	Dispositifs moléculaires	1-HL-U	Tenez l’électrode d’enregistrement et connectez-vous à la tête
Transducteur pneumatique	Fluke Biomedical Instruments	DPM1B	Pour le contrôle de la pression interne de l’électrode d’enregistrement
Hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	Référence 221473-25G	Agent de gravure pour goupilles de dissection
Tubes en silicone	Tygon	Référence 14-169-1A	Tube pour connecter le transducteur pneumatique au porte-pipette
Stéréomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Utilisé pour visualiser les pointes des épingles et pendant la préparation des larves
Lame de rasoir à bord droit	Canope	Commandez chez amazon.com	Coupe le fil de tungstène lors de la fabrication des broches de dissection
seringue	Becton Dickinson Compoany	309602	Rempli de solution extracellulaire à injecter dans des électrodes d’enregistrement
Pipette de transfert	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Pipette à usage unique, non stérile, pour le transfert des larves
Méthanesulfonate de tricaïne	Syndel	Référence 12854	Anesthésique pharmaceutique utilisé pour euthanasier les larves à fort dosage.
Fil de tungstène	World Precision Instruments Inc.	Référence 715500	0,002 pouce, 50,8 μm de diamètre ; utilisé pour fabriquer des broches de dissection
Unité de filtration sous vide	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Unités de filtration sous vide stériles à usage unique utilisées pour stériliser la solution extracellulaire utilisée pour la sonnerie d’électrodes d’électrophysiologie
Tension à pince de courant	Dispositifs moléculaires	CV-7B	Livré avec l’amplificateur MultiClamp 700B utilisé comme étages supérieurs gauche et droit
α-bungarotoxine	ThermoFisher	Réf. B1601	Pour immobiliser les larves avant l’enregistrement