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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Préparation de tranches de cerveau d’hippocampe aigu
- Préparation des solutions en tranches
- Préparez une solution de bouture de saccharose de 500 mL composée de : 194 mM de saccharose, 30 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 10 mM de D-glucose, 1 mM de MgCl2, 1,2 mM de NaH2PO4 et 26 mM de NaHCO3, 290-300 mOsm, saturés de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2.
- Préparer 1 à 2 litres de solution d’enregistrement (liquide céphalo-rachidien artificiel, ACSF) composée de : 124 mM de NaCl, 4,5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de D-glucose, 2 mM de CaCl2, 1,2 mM de NaH2PO4 et 26 mM de NaHCO3 ; pH de 7,3 à 7,4 (après bulles), 290 à 300 mOsm, saturé de 95 % d’O2 et de 5 % de CO2. Remplissez un bécher contenant une chambre porte-tranche de cerveau avec une solution d’enregistrement et maintenez-la à 32-34 °C. Remplissez la chambre du vibratome avec de la gadoue d’eau glacée.
- Préparation aiguë des tranches
- Anesthésie profondément une souris en la plaçant dans un bocal préchargé de 2 à 3 ml d’isoflurane. Vérifiez s’il n’y a pas de réflexe de pincement de l’orteil et, s’il ne répond pas, décapitez-le rapidement à l’aide d’une paire de ciseaux tranchants ou d’une guillotine, comme l’exige le protocole de votre animal.
- Faites une incision de 2 à 3 cm à l’aide de ciseaux de la partie caudale du crâne pour couper le cuir chevelu le long de la ligne médiane. Tout en rétractant manuellement le cuir chevelu, faites deux incisions horizontales de 1 cm à partir du foramen magnum le long des côtés du crâne. Ensuite, à l’aide de ciseaux fins, faites une incision sur la longueur du crâne, le long de la ligne médiane de l’arrière du crâne jusqu’au nez.
- À l’aide d’une pince fine insérée près de la ligne médiane, rétractez le crâne incisé en deux parties. Extrayez le cerveau de la souris du crâne et utilisez une lame pour retirer le cervelet et les bulbes olfactifs, qui sont respectivement situés dans les parties caudale et rostrale du cerveau. Ceux-ci peuvent être identifiés par les grandes fissures, qui les séparent du cortex.
- Montez le bloc cérébral sur le plateau du vibratome à l’aide de super colle. Remplissez le plateau du vibratome avec une solution de découpe glacée.
- Découpez des coupes de tissu sur le plan coronal à 300 μm d’épaisseur. Habituellement, 6 tranches coronales de l’hippocampe peuvent être collectées.
- Une fois chaque section coupée, transférez immédiatement les tranches dans le bécher de maintien de la tranche chauffé à 32-34°C. Gardez les sections à cette température pendant 20 min avant de retirer le bécher contenant les sections et placez-le à température ambiante pendant au moins 20-30 minutes avant l’enregistrement.
2. Mesure de la dynamique K+ évoquée électriquement
- Mise en place de la préparation des tranches
- Placez délicatement la tranche de cerveau dans le bain à l’aide d’une pipette Pasteur et maintenez-la doucement en place avec une harpe en platine avec des cordes en nylon.
- Assurez-vous que les pointes de l’électrode de stimulation bipolaire sont parallèles les unes aux autres et qu’elles sont au niveau du plan de la tranche. Lentement, pendant 6 à 7 secondes, insérez les électrodes dans le radiatum de la couche CA3 à environ 40 à 50 μm de profondeur pour stimuler les collatéraux de Schaffer. Dans les coupes coronales, CA3 peut être approximativement identifié comme la partie de l’hippocampe proprement dite latérale à la couche de cellules granulaires au niveau du genre de l’hippocampe, la couche radiale tombant médialement et ventrale à la couche cellulaire pyramidale.
- Insérez avec précaution l’électrode sélective K+ dans la couche radiale CA1 à environ 50 μm de profondeur, en abaissant lentement l’électrode pendant environ 3 à 4 secondes. Laissez le potentiel se stabiliser à travers l’électrode avant d’appliquer des stimulations sur la tranche : cela prend généralement 5 à 10 minutes. Si la tranche présente des changements spontanés de K+ extracellulaire, jetez-la et répétez ce processus avec une nouvelle tranche.
- Mesure de la libération de K+ évoqué
- Appliquez des trains de stimulation électrique (8 impulsions) en appuyant manuellement sur la gâchette du stimulateur tout en enregistrant numériquement les réponses. Appliquez une stimulation à 10 Hz et une largeur d’impulsion de 1 ms, à partir d’une amplitude de stimulus de 10 μA.
- Appliquez des amplitudes de stimulation croissantes d’un facteur 2 jusqu’à ce qu’une amplitude de réponse maximale K+ soit détectée. Si vous ne voyez aucune réponse, rapprochez la position de l’électrode K+ du site de stimulation par incréments de 100 μm
- Déterminez l’amplitude du stimulus qui produit la réponse demi-maximale. D’après notre expérience, cela se situe entre 40 et 160 μA, en fonction de la qualité de la préparation, de l’âge de l’animal et de la distance entre les électrodes de stimulation et l’électrode sélective K+.
- Dans la même tranche, en utilisant une amplitude de stimulus d’un cran plus basse que l’amplitude qui produit la réponse demi-maximale (par exemple, si 80 μA produit une réponse demi-maximale, utilisez 40 μA) appliquez des trains de stimulus d’un nombre croissant d’impulsions. Initialement, nous avons utilisé des trains de 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 et 128 impulsions.
- Pour confirmer que les signaux K+ sont médiés par l’activation du potentiel d’action du bain collatéral de Schaffer stimulé électriquement, appliquez de la tétrodotoxine (TTX) de 0,5 μM dans l’ACSF pendant 10 minutes et répétez le protocole de stimulation. Aucune réponse évoquée ne doit être observée.
- Après avoir terminé l’expérience de coupe, confirmez que l’électrode a conservé sa réactivité en recalibrant l’électrode dans les solutions d’étalonnage et en vous assurant que la réponse n’a pas dévié de plus de 10 % par rapport à l’étalonnage initial