$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
REMARQUE : Les enregistrements de Q175 de type sauvage (WT) et hétérozygotes (HETs) peuvent être réalisés à n’importe quel âge et sexe. Ici, nous avons étudié des mâles et des femelles âgés de 51 à 76 semaines.
1. Injection du capteur de glutamate iGluu pour l’expression dans les axones corticostriataux
- Utilisez l’extracteur de pipette (mode un pas) pour préparer les pipettes en verre borosilicaté pour l’injection du virus. Après avoir tiré, cassez la pipette manuellement pour obtenir un diamètre de pointe de 30 à 50 μm. Autoclave la pipette et les instruments chirurgicaux, y compris la perceuse pour l’ouverture du crâne.
- Stockez le virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) à -80 °C dans des aliquotes de 10 μL. Si les injections sont effectuées peu de temps après la production du virus (dans les 6 mois), conserver à 5 °C. Avant l’opération, sortez le flacon et conservez-le à température ambiante.
- Remplissez la pipette en verre et retirez les bulles.
- Anesthésier l’animal par injection intrapéritonéale d’une solution contenant 87,5 mg/kg de kétamine et 12,5 mg/kg de xylazine. Injecter par voie sous-cutanée 0,25 % de bupivacaïne (8 mg/kg) pour un soulagement supplémentaire de la douleur. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en surveillant le tonus musculaire et en observant l’absence de réflexes induits par la douleur.
- Rasez la peau de la tête et stérilisez-la avec de l’alcool à 70 %. Insérez la souris dans le cadre stéréotaxique.
- À l’aide d’un scalpel pour enlever la peau et d’une perceuse à grande vitesse (38 000 tr/min) pour faire un trou de 1,2 mm dans l’os au-dessus du cortex moteur.
- Montez la seringue avec la pipette d’injection attachée dans le support d’un manipulateur de précision. Insérez la pipette orientée verticalement dans le cortex à 4 endroits différents. Les coordonnées d’injection sont, par rapport au bregma (en mm) : antérieure 1,5, latérale 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. La profondeur par rapport à la dure-mère est (en mm) : 1,5–1,7.
- À l’aide du système d’injection, injecter 0,3 μL par site de la solution virale non diluée à une vitesse de 0,05 μL/min. Après chaque injection, laissez la pipette en place pendant 1 min avant de la retirer lentement (1 mm/min).
- Terminez en fermant la plaie chirurgicale à l’aide d’une suture en nylon.
- Laissez la souris pendant 0,5 à 1 h sur un coussin chauffant dans une cage propre avant de la remettre dans sa cage d’origine.
- Maintenez la souris sur un cycle jour-nuit de 12 h pendant 6 à 8 semaines avant la préparation des tranches de cerveau aiguës.
note: Pour éviter des réactions immunitaires entraînant des lésions cellulaires et une perte de synapses, l’injection de plusieurs constructions virales doit être effectuée simultanément ou dans les 2 à 3 heures suivant l’injection primaire. Les coordonnées de l’injection d’iGluu ont été sélectionnées selon l’atlas cérébral de Paxinos et de Franklin. Ils correspondent au cortex moteur M1. L’immunomarquage des cerveaux injectés a permis de visualiser de nombreux axones et varicosités axonales bien isolés dans le striatum ipsi- et controlatéral et dans les cortex controlatéraux M1 et S1.
2. Recherche de terminaux glutamatergiques exprimant le capteur de glutamate iGluu
- Mode d’étalonnage
- Préparez la caméra sCMOS et le logiciel de contrôle de la caméra avec les paramètres suivants. Sur la page Lecture, définissez Taux de lecture des pixels : 560 MHz (= lecture la plus rapide), Sensibilité/Plage dynamique : bit, Filtre de bruit parasite : Oui, Lecture de chevauchement : Oui. Sur la page Binning/ROI, sélectionnez Plein écran.
- Préparez une lame de verre contenant une goutte de 5 mg/mL de Lucifer Yellow (LY) sous une lamelle.
- Placez la glissière LY sous un objectif 63x, ouvrez l’obturateur laser et effectuez une acquisition série en utilisant les paramètres suivants : Pixel Binning : 1x1, Mode de déclenchement : Interne, Temps d’exposition : Minimal (à déterminer).
- Ajustez la puissance du laser pour produire un point de fluorescence de 4 μm de diamètre (l’image ne doit pas contenir de pixels saturés).
- Pour effectuer un étalonnage du système de positionnement laser, sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de positionnement laser : Diamètre du spot : 10, Vitesse de balayage : 43,200 kHz. Cliquez sur le bouton Démarrer l’acquisition d’image dans le panneau de droite. Définissez Exécutions : 0, Délai d’exécution : 0, puis sélectionnez l’option Exécuter à TTL sur la page Séquence. Cliquez sur le bouton Calibrer sur la page Étalonnage et calibrez le logiciel de contrôle laser conformément aux instructions affichées dans le coin supérieur gauche de l’écran d’acquisition.
- Si le programme d’installation utilise un logiciel indépendant pour le contrôle de la caméra et du laser, acquérez des captures d’écran à partir de la fenêtre d’acquisition de la caméra et envoyez-les au logiciel de contrôle laser pour un nouveau calcul des coordonnées XY. Si le logiciel est installé sur différents ordinateurs, utilisez une carte d’acquisition vidéo pour importer l’image dans le logiciel de contrôle laser. Le logiciel de contrôle laser aura besoin des informations sur les facteurs d’échelle XY et les décalages. Pour ce faire, déterminez les coordonnées des coins supérieur gauche, inférieur gauche et inférieur droit de l’image dans la fenêtre d’acquisition du programme de contrôle laser. Calculez les facteurs d’échelle selon les équations suivantes : Facteur X = (X en bas à droite – X en bas à gauche)/2048, Décalage X = X en bas à gauche, Facteur Y = (Y en haut à gauche – Y en bas à gauche)/2048, Décalage Y = Y en bas à gauche.
- À la fin de la procédure d’étalonnage, créez une région d’intérêt (ROI) rectangulaire de 267 x 460 pixels, déplacez-la au centre de l’écran et cliquez sur le bouton Démarrer la séquence.
- Revenez aux paramètres suivants du logiciel de contrôle de l’appareil photo : Binning : 2x2, Mode de déclenchement : Exposition externe, Temps d’exposition : Minimal (à déterminer).
- Mode de correction de l’autofluorescence
REMARQUE : Le niveau de repos de [Glu] dans l’environnement des terminaisons synaptiques actives est généralement inférieur à 100 nM. En conséquence, tout capteur de glutamate, en particulier un capteur de faible affinité comme iGluu, sera plutôt faible en l’absence de libération synaptique de glutamate. Néanmoins, une partie de la fluorescence iGluu peut même être détectée au repos, mais doit être distinguée de l’autofluorescence tissulaire. L’éclairage de 473 nm provoque à la fois la fluorescence et l’autofluorescence (Figure 1A–C). Ce dernier occupe une large gamme de longueurs d’onde, tandis que la fluorescence iGluu est limitée à 480-580 nm (avec un maximum à 510 nm). La correction de l’autofluorescence est basée sur l’acquisition de deux images avec des filtres passe-haut différents.
- Préparez des tranches de cerveau à l’avance comme décrit ailleurs. Gardez les tranches de son prêtes.
- Transférez les tranches dans la chambre d’enregistrement, en les immergeant dans un liquide cérébro-rachidien artificiel oxygéné (ACSF) contenant 125 mM de chlorure de sodium (NaCl), 3 mM de chlorure de potassium (KCl), 1,25 mM de phosphate d’hydrogène sodique (NaH2PO4), 25 mM de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 2 mM de chlorure de calcium (CaCl2), 1 mM de chlorure de magnésium (MgCl2), 10 mM de glucose (pH 7,3, 303 mOsm/L), complété par 0,5 mM de pyruvate de sodium, 2,8 mM d’ascorbate de sodium et 0,005 mM de glutathion. Utilisez un débit de 1 à 2 ml/min. Maintenez la température du bain entre 28 et 30 °C.
- Localisez le striatum dorsal sous un objectif d’immersion dans l’eau 20x. Fixez les tranches avec une grille en nylon sur une harpe en platine pour minimiser le mouvement des tissus. Passez à l’objectif d’immersion dans l’eau 63x /NA 1.0. Sélectionnez des filtres réfléchissant la lumière à 473 nm (miroir dichroïque) et la lumière passant avec des longueurs d’onde >510 nm (filtre d’émission).
- Synchronisez l’éclairage, la stimulation et l’acquisition d’images à l’aide d’une carte analogique-numérique (AD)/numérique-analogique (DA) (AD/DA) avec le logiciel de commande correspondant. Réglez le programme de déclenchement pour contrôler l’acquisition avec un temps d’exposition laser de 180 ms et un temps d’acquisition d’image de 160 ms. Utilisez le dispositif de positionnement laser pour envoyer le faisceau laser à un nombre prédéterminé de points et définissez les paramètres de vitesse de balayage et de taille du spot.
- Acquérez une image de l’autofluorescence et des structuresu-positives d’iGlu à l’aide d’un filtre passe-haut à 510 nm (« image jaune »).
- Acquérez une image avec l’autofluorescence seule à l’aide d’un filtre passe-haut à 600 nm (« image rouge »).
- Mettez à l’échelle les images rouges et jaunes, en utilisant les intensités moyennes des 10 pixels les plus clairs et des 10 pixels les plus sombres pour définir la plage. Effectuez une soustraction « image jaune moins rouge » et redimensionnez l’image soustraite pour générer un fichier tif standard 8 bits pour une visualisation pratique du bouton qui vous intéresse (Figure 1D). Il contient les pixels brillants des structuresiGlu u-positives, les pixels gris de l’arrière-plan et les pixels sombres des structures avec autofluorescence.
note: Avec l’équipement fourni, la fluorescence moyenne au repos (F) sera inférieure à 700 UA.
- Bouton search mode
REMARQUE : Les pixelsiGlu u-positifs peuvent appartenir à des éléments fonctionnellement différents de l’arbre axonal, tels que des branches axonales d’ordre différent, des sites de bifurcation, des varicosités après l’épuisement des vésicules ou des varicosités entièrement actives. Cependant, il est presque impossible d’identifier les terminaisons synaptiques fonctionnelles par une simple inspection visuelle. Par conséquent, chaque terminaison synaptique glutamatergique doit être identifiée par sa réactivité à la dépolarisation électrique. Les sites qui ne répondent pas à la stimulation doivent être éliminés. Le moyen physiologique d’induire la libération de glutamate à partir des axones corticostriataux est de susciter un potentiel d’action. Cela peut être réalisé soit en utilisant un canal rhodopsine de caractéristiques spectrales appropriées, soit par stimulation électrique d’un axone visualisé par iGluu lui-même. Pour éviter l’activation accidentelle de l’opsine, nous avons préféré ce dernier approastep
- Utilisez l’extracteur de micropipettes (en mode quatre étapes) pour produire des pipettes de stimulation à partir de capillaires en verre borosilicaté. Le diamètre interne de la pointe doit être d’environ 1 μm. Lorsqu’elle est remplie d’ACSF, la résistance de l’électrode doit être d’environ 10 MΩ.
- Pour induire la libération de glutamate dépendante du potentiel d’action à partir d’un ensemble de boutons synaptiques attachés au même axone, utilisez un grossissement de 63x, le filtre d’émission de 510 nm et l’image soustraite pour placer une électrode de stimulation en verre à côté d’une varicosité fluorescente. Évitez la proximité d’axones supplémentaires.
- Allumez le stimulateur pour délivrer des impulsions de courant dépolarisantes à la pipette de stimulation. Utilisez des intensités de courant d’environ 2 μA (pas plus de 10 μA).
- Activez le système d’application de bain multicanaux où un canal fournit la solution de bain standard et les autres canaux délivrent les bloqueurs nécessaires des canaux ioniques, des transporteurs ou des récepteurs membranaires. Contrôlez le débit sur le site d’enregistrement, puis passez au canal de la tétrodotoxine (TTX) (solution de bain plus 1 μM TTX). Après 2 à 3 minutes, stimulez à nouveau le bouton d’intérêt, mais cette fois en l’absence de génération de potentiel d’action. La libération est directement due à l’afflux de calcium à travers les canaux calciques dépendants de la tension.
- En tournant la touche d’intensité du stimulateur, ajustez le courant de stimulation pour obtenir des réponses similaires à celles provoquées par les potentiels d’action. En règle générale, le courant de stimulation serait d’environ 6 μA pour une dépolarisation de 0,5 ms.
- Pour l’essai de base de la préparation, appliquer 0,5 mM CdCl2. La présence de cette libération de glutamate inhibiteur des canaux calciques empêche complètement la libération synaptique de glutamate, validant ainsi la dépendance calcique du signal de glutamate directement évoqué.
note: La recommandation générale suivante peut aider à augmenter le taux de réussite des expériences de synapse unique dans le striatum. Pour sélectionner des terminaisons synaptiques glutamatergiques avec une machinerie de libération intacte, une varicosité doit : (i) avoir une forme lisse en forme de fuseau ; (ii) Ne pas être associé à une bifurcation axonale ; (iii) Être plus lumineux que les autres structures de l'« image jaune » ; (iv) Résident dans le neuropil striatal plutôt que dans les faisceaux fibreux ; (v) Résident sur une branche axonale très mince ; (vi) Ne pas résider dans les parties les plus profondes de la tranche.
3. Visualisation de la libération et de l’élimination du glutamate
- Mode d’enregistrement
REMARQUE : Après la soustraction de l’autofluorescence (étape 2.2) et quelques tests initiaux de réactivité du bouton d’intérêt (étape 2.3), l’acquisition des données peut commencer. Les réponses à l’activation électrique de la libération de glutamate à partir des terminaisons axonales uniques peuvent être observées directement dans l’image (Figure 2), sans appliquer d’autres outils d’analyse. Cependant, il s’est avéré très pratique d’extraire immédiatement certains indicateurs de base de la performance des synapses (Figure 3). Ces informations sont nécessaires pour prendre des décisions sur le déroulement ultérieur de l’expérience, telles que la sélection de types terminaux particuliers, l’évaluation rapide des altérations liées à la MH, le nombre et la fréquence des essais ou des médicaments à appliquer avec le système de superfusion. Il peut également être nécessaire de faire face à des artefacts qui finissent par apparaître. Tout d’abord, les paramètres standard pour l’enregistrement des données sont décrits.
- À l’aide des lecteurs XY du microscope, placez le bouton iGluu-positive testé près du centre du champ de vision. Arrêtez l’acquisition d’images à l’aide du bouton Abandonner l’acquisition. Sur la dernière image acquise, déterminez la position XY du centre du bouton de repos en cliquant dessus avec le bouton gauche de la souris. Les coordonnées XY du curseur défini seront affichées sur le panneau d’état inférieur de la fenêtre d’acquisition.
- À l’aide des données d’étalonnage (étape 2.1.6), calculez les coordonnées du site où le faisceau laser doit être envoyé pour l’excitation de la fluorescence iGlu. Utilisez les équations suivantes : Laser X = Caméra X * Facteur X + Décalage X, Laser Y = Décalage Y – Caméra Y * Facteur Y. Lors de ce recalcul, faites attention aux paramètres de retournement vertical ou horizontal de l’appareil photo.
- Créez une séquence en un point dans le logiciel de contrôle laser à l’aide des coordonnées calculées. Pour ce faire, sélectionnez Point dans la case Ajouter à la séquence de la page Séquence du logiciel de contrôle laser. Sélectionnez 10 μs pour le délai de déclenchement et 180 ms pour le temps d’impulsion laser. Déplacez la souris sur les coordonnées calculées et cliquez sur le bouton gauche.
- Sélectionnez les paramètres suivants dans le logiciel de contrôle laser : Exécutions : 0, Délai d’exécution : 0, Séquence : Exécution à TTL. Cliquez ensuite sur Démarrer la séquence.
- Dans le logiciel de contrôle de la caméra, sélectionnez les paramètres suivants : Sur la page Binning/ROI, définissez Zone d’image : Personnalisée, Pixel Binning : 2x2, Hauteur : 20, Largeur : 20, Gauche : Coordonnée X du spotiGlu u-positif au repos moins 10 px, Bas : Coordonnée Y du spotiGlu u-positif au repos moins 10 px, Mode d’acquisition : Série cinétique, Longueur de la série cinétique : 400, temps d’exposition : 0.0003744s (valeur minimale). Avec de tels réglages, la fréquence d’acquisition sera de 2,48 kHz.
- Sélectionnez Mode de déclenchement : Externe. Cliquez sur Prendre le signal dans le logiciel de contrôle de l’appareil photo. Initier le protocole expérimental établi pour le dispositif de déclenchement.
- Mettre en œuvre le protocole expérimental Essai avec la chronologie suivante : 0 ms – début de l’essai, 1 ms – démarrage de l’éclairage laser, 20 ms – début de l’acquisition d’images avec caméra, 70 ms – démarrage de l’électrostimulation 1, 120 – début de l’électrostimulation 2, 181 ms – fin de l’essai (laser et caméra éteints). Ainsi, au cours d’un essai, la caméra acquiert 400 images avec une fréquence de 2,48 kHz. Voir les étapes 2.3.3 et 2.3.5. pour plus de détails sur la stimulation électrique.
- Pour permettre une récupération suffisante des pools de vésicules présynaptiques, appliquez le protocole Trial avec une fréquence de répétition de 0,1 Hz ou moins.
- Construction hors ligne du glutamate transitoire et évaluation rapide de la libération et de la clairance du glutamate pour l’identification des synapses pathologiques
- Activez les routines d’évaluation. Ici, nous utilisons un logiciel écrit en interne, SynBout v. 3.2. (auteur : Anton Dvorzhak). Les étapes suivantes sont nécessaires pour construire un transitoire ΔF/F à partir des pixels avec une fluorescence iGluu élevée, comme dans la vidéo de la figure 2.
- Pour déterminer la taille du bouton, calculez la moyenne et l’écart-type (ET) de l’intensité de fluorescence ROI au repos (F), avant le début de la stimulation. Déterminez et encadrez la zone occupée par les pixels avec la moyenne F> + 3 SD (Figure 3A). Déterminez un diamètre virtuel (en μm) en prenant une forme circulaire de l’aire au-dessus du seuil.
- Déterminez ΔF comme la différence entre la valeur de l’intensité de crête et F. Tracez le courant de stimulation et ΔF/F en fonction du temps (Figure 3B). Calculez l’écart-type de ΔF/F au repos (avant le début de la stimulation) et l’amplitude maximale. Utilisez un pixel avec une amplitude de crête supérieure à 3 SD de ΔF/F pour effectuer un ajustement monoexponentiel pour la décroissance à partir du pic. Déterminez la constante de temps de décroissance TauD de ΔF/F.
- Pour estimer l'« amplitude maximale » à une synapse donnée, sélectionnez le pixel avec la valeur ΔF/F la plus élevée. Il est généralement situé à l’intérieur ou à côté des limites du bouton de repos iGluu fluorescence. L'« amplitude maximale » serait le meilleur indicateur de la charge de glutamate présentée à la machinerie de clairance d’une seule synapse.
